替米沙坦對(duì)糖尿病大鼠腎臟組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞凋亡影響的研究.pdf

1、背景和目的
　　 糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病中十分常見和嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎臟疾病(end stage renal disease，ESRD)的重要因素之一，文獻(xiàn)研究表明，細(xì)胞凋亡作為一原發(fā)和獨(dú)立的因素在DN的發(fā)病過程中起到不可忽視的作用。近年來研究證明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)介導(dǎo)的凋亡途徑是一種新發(fā)現(xiàn)的凋亡途徑，在糖尿

2、病的發(fā)生發(fā)展中可能起一定的作用。因此，抗ERS治療成為了治療糖尿病及其并發(fā)癥的一個(gè)新選擇。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)被普遍用于治療DN，通過降低血壓和減少尿蛋白，延緩DN的發(fā)展。但其具體作用機(jī)制尚未完全明了。
　　 本試驗(yàn)通過腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)構(gòu)建糖尿病大鼠模型，根據(jù)各組大鼠一般生化指標(biāo)的變化和腎組織中ERS介導(dǎo)的凋亡途徑中相關(guān)的因子GRP78、CHOP和Caspase12的表達(dá)情況，來探討ERS介導(dǎo)的凋亡在DN

3、發(fā)生發(fā)展中的作用以及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑替米沙坦對(duì)糖尿病大鼠ERS相關(guān)腎臟細(xì)胞凋亡系統(tǒng)的干預(yù)和影響。
　　 材料與方法
　　 SD雄性健康大鼠48只，正常對(duì)照組(NC組)(n=10只)。38只大鼠采用腹腔注射STZ60mg/kg，制備糖尿病大鼠模型(其中8只大鼠造模未成功予以剔除)，造模成功大鼠分成二組：糖尿病組(DM組)(n=15只)、替米沙坦干預(yù)組(DT組)(n=15只)。各組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，DT組大鼠每日上

4、午給與替米沙坦(10mg/kg，溶于蒸餾水中)灌胃，DM組和NC組大鼠只給與等量蒸餾水灌胃，共12周。試驗(yàn)結(jié)束后測(cè)量各組大鼠的體重、右腎的重量和24h尿蛋白排泄量，并抽取腹主動(dòng)脈血檢測(cè)血糖、血胰島素、血肌酐等生化指標(biāo)；同時(shí)留取適量腎臟組織分別做免疫組化及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，檢測(cè)GRP78、Caspase12和CHOP蛋白及mRNA的表達(dá)水平；采用原位末端標(biāo)記凋亡細(xì)胞(TUNEL)法檢測(cè)腎臟細(xì)胞凋亡程度。并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)

5、分析，選取α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.DM模型建成后，6只大鼠因血糖下降不達(dá)標(biāo)被剔除。實(shí)驗(yàn)過程中DM組2只大鼠死亡，DT組1只死亡，最終共31只完成實(shí)驗(yàn)。DM組大鼠血糖較NC組明顯增高(P<0.05)。HE染色：DM組大鼠腎小球肥大，血管腔受壓，基底膜增厚，系膜區(qū)增寬和細(xì)胞外基質(zhì)增多，部分腎小球體積縮小、出現(xiàn)硬化；Masson染色：DM大鼠腎組織內(nèi)膠原組織明顯增多，粗大膠原纖維相互連接成網(wǎng)狀，排列

6、紊亂，分布不勻。DM組24h尿蛋白顯著高于NC組(P<0.05)。血肌酐的水平在DM組也明顯升高(P<0.05)。此結(jié)果提示，1型糖尿病DN模型建造成功。
　　 2.TUNEL法檢測(cè)腎臟細(xì)胞的凋亡，結(jié)果顯示：陽性染色信號(hào)定位于腎臟細(xì)胞核內(nèi)，呈棕黃色，體積等于或小于正常細(xì)胞核；NC組偶見細(xì)胞凋亡，凋亡指數(shù)為(2.71±0.19)％，DM組凋亡指數(shù)為(25.75±2.72)％，DM組顯著高于NC組(P<0.05)。相關(guān)分析顯示，NC

7、組和DM組中24h尿蛋白與腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)之間均呈顯著正相關(guān)(均P<0.05)。
　　 3.與NC組相比較，DM組的GRP78、Caspase12蛋白及其mRNA表達(dá)和CHOPmRNA的表達(dá)均顯著增高(P<0.05)。NC組和DM組GRP78、Caspase12及CHOP mRNA及蛋白的表達(dá)程度與腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)之間均呈顯著正相關(guān)(均P<0.05)。
　　 4.與NC組相比較，DT組大鼠腎小球和腎小管的病理變化及膠原纖

8、維化明顯減輕，24h尿蛋白值、血肌酐值顯著降低(P<0.05)，TUNEL法檢測(cè)DT組大鼠腎臟細(xì)胞的凋亡程度也顯著減少(P<0.05)。同時(shí)，GRP78、Caspase12、CHOP蛋白及其mRNA的表達(dá)水平均較DM組有明顯的降低(P<0.05)。另外，DT組24h尿蛋白與腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)之間也呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。對(duì)GRP78、Caspase12和CHOP mRNA及蛋白與腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)之間進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果亦顯示它們之間

9、存在顯著正相關(guān)(均P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.GRP78、CHOP、Caspase12 mRAN及其蛋白在DM大鼠腎臟組織中表達(dá)異常增加，且與腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)之間呈顯著正相關(guān)，而腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)與24h尿蛋白之間也呈顯著正相關(guān)，提示ERS介導(dǎo)的凋亡途徑在DN的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。
　　 2.替米沙坦可能通過降低腎臟組織中ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡因子GRP78、CHOP、Caspase12蛋白及其mRN