早幼粒細胞白血病蛋白和相關(guān)因子在肺癌的表達以及臨床意義.pdf

1、研究背景和目的：自20世紀70年代以來，中國的惡性腫瘤發(fā)病率和病死率呈明顯上升趨勢，現(xiàn)已成為我國城鄉(xiāng)居民的首要死因。其中，肺癌發(fā)病率和病死率的上升趨勢尤為明顯，雖然以手術(shù)為主的多學(xué)科綜合治療以及個體化治療的進步，其病死率位列所有惡性腫瘤之首，早期發(fā)現(xiàn)和早期治療仍然被認為是治療這類惡性疾病的主要策略。PML(promyelocytic leukemia)基因是在對急性早幼粒細胞白血病(APL)發(fā)病機制的研究中被發(fā)現(xiàn)，被認為在所有APL的發(fā)

2、生發(fā)展過程中出現(xiàn)變異。通過對APL以及包括肝癌、乳腺癌、膀胱癌和前列腺癌等在內(nèi)的實體腫瘤的研究中，PML蛋白表現(xiàn)出具有調(diào)節(jié)細胞分化、誘導(dǎo)凋亡和老化的重要作用。利用腺病毒把PML基因轉(zhuǎn)染四種不同肝癌細胞后，高表達PML蛋白首先誘導(dǎo)全部四種細胞在G1期出現(xiàn)細胞周期停滯，然后引發(fā)廣泛細胞死亡。隨著時間延長，其誘導(dǎo)細胞死亡的效力甚至大于轉(zhuǎn)染p53的作用。PML基因與肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系不清。通過在美國Pubmed和中國CNKI數(shù)據(jù)庫的檢索，關(guān)于肺

3、癌和PML基因的研究寥寥3篇，樣本量較少(共87例)，并且缺乏臨床和預(yù)后相關(guān)性的分析。為此通過構(gòu)建包含正常肺組織、肺良性腫瘤和肺癌的組織芯片，探究PML、：P53、P16<'INK4A>、Bcl-2、Survivin和Cox-2蛋白在這些組織的表達以及與臨床預(yù)后之間的關(guān)系。 方法： 1、標本來源 1998年1月1日至2000年6月30日，在中國醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院胸外科手術(shù)治療的肺癌患者148例，手術(shù)前未行放化療，同

4、期肺良性腫瘤5例、肺正常組織7例，共計160例。手術(shù)標本構(gòu)建組織芯片，其中有4例肺癌組織因為取樣失誤以及免疫組織化學(xué)染色后脫片被排除。 2、組織芯片的質(zhì)檢使用兔抗人COX-2單克隆抗體對組織芯片與普通切片進行免疫組化S-P法染色，驗證組織芯片與大體切片的符合率； 3、免疫組織化學(xué)染色方法利用組織芯片進行免疫組化染色，檢測PML、P53、P16<'INK4A>、Bcl-2、Survivin和Cox-2的表達，分析相互間的相

5、關(guān)性，以及同臨床特點和預(yù)后的聯(lián)系； 4、提取RNA進行RT-PCR篩選40例PML蛋白無表達石蠟包埋肺癌組織(保存時間在60～85個月，平均69個月)，利用Trizol一步法提取總RNA，與新鮮肺癌組織中提取的RNA進行比較，并利用：RT-PCR檢驗PML基因轉(zhuǎn)錄情況。 5、統(tǒng)計方法 數(shù)據(jù)分析利用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件完成，P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。陽性率比較采用列聯(lián)表法，若例數(shù)(N)>40，且最小期望頻

6、數(shù)(n)>1，使用．Pearson卡方檢驗進行統(tǒng)計；若N>40，1

7、的脫片率<3％。COX-2在普通切片的陽性率為55％(33/60)，組織芯片中4個和3個點的陽性率都為53.3％(32/60)，2個和1個點的陽性率分別為50％(30/60)、46.7％(28/60)。COX-2在普通切片的陽性率同組織芯片1至4個點的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 2、各因子表達結(jié)果和意義144例肺癌中，PML于細胞核著色40例、漿著色26例，細胞漿、核共表達12例；其中，NSCLC和SCLC細胞核表達率分別為31.4％和

8、8.7％(P=0.026)：NSCLC和SCLC的PML細胞漿表達率分別為14％和39.1％(P=0.01)。良性腫瘤中，PML強表達于兩例肺平滑肌瘤的細胞核；肺癌中PML表達多為弱陽性(46/54)；PML表達的SCLC病人5年累積生存率50％(中位54個月)，高于陰性表達病人的23％(中位13個月)，差異有顯著性。Cox單因素和多因素分析均顯示PML是SCLC病人預(yù)后的獨立影響因素。 P53在肺癌的陽性率為33.3％(48/144)

9、，在肺良性腫瘤和正常肺組織無表達(P=0.038)。NSCLC和SCLC的P53表達率分別為33.1％(40/121)和34.8％(8/21)，其中，正常肺組織和肺良性腫瘤與NSCLC比較，差異有顯著性(P=0.040)；而與SCLC比較差異有臨界顯著性(P=0.057)。P16m<'INK4A>在肺癌中表達率為28.5％(41/144)，正常肺組織和肺良性腫瘤P16<'INK4A>陽性率為8.3％(1/12)，僅有一例肺平滑肌瘤弱表達

10、，P16<'INK4A>在SCLC高表達，表達率為69.6％(16/23)，在NSCLC的為20.7％(25/121)；此外，高度或中度分化腫瘤的P16<'INK4A>表達率為20％，低度或未分化腫瘤的為36.5％(P=0.028)。 Survivin在肺癌的陽性率為90.3％(130/144)，正常肺組織和肺良性腫瘤的陽性率為58.3％(7/12)(P=0.005)；NSCLC的Survivin表達率為91.7％，SCLC的8

11、2.6％；此外，病人年齡在60歲以下肺癌中，Survivm的表達率明顯增高(95.3％vs．83.1％，P=0.015)。Bcl-2在肺癌高表達，表達率為52.8％(76/144)，而在肺正常組織和良性腫瘤低表達，陽性率為16.7％(2/12，P=0.016)；鱗癌的Bcl-2表達明顯高于腺癌(86.7％vs．27.4％，P<0.001)。COX-2在肺癌的陽性率為61.8％(89/144)，而在肺正常組織和良性腫瘤為25％(3/12，

12、P=0.029)；在NSCLC的表達率為66.9％，在SCLC的表達率為34.8％(p=0.004)；女性、中高度分化、不吸煙病人肺癌中COX-2的表達率顯著增高；與鱗癌相比，腺癌中COX-2的表達率增高(79％vs．48.9％，P=0.001)。 144例肺癌中，PML與Survivm正相關(guān)(P<0.001，r=0.313)，PML細胞核表達同P16負相關(guān)，P53與P16、Bcl-2正相關(guān)，COX-2與Survivin正相關(guān)，

13、但與Bcl-2負相關(guān)。NSCLC中，PML與Survivm正相關(guān)(P=0.003，r=0.266)，P53與Bel-2正相關(guān)，COX-2與Survivin正相關(guān)，而同Bcl-2負相關(guān)；腺癌中，PML與Survivm的表達正相關(guān)(P=0.039，r=0.263)，P53與P16、Bcl-2正相關(guān)，COX-2與Survivin正相關(guān)；鱗癌中，PML，與P53和：Bcl-2均負相關(guān)，COX-2與Survivin正相關(guān)；SCLC中，各種因子之間

14、未呈現(xiàn)相關(guān)性。 3、RNA提取結(jié)果和PML mRNA表達情況自新鮮冰凍組織和石蠟包埋組織提取RNA的OD<,260>/OD<,280>范圍在1.9～2.1；RNA提取質(zhì)量電泳圖顯示：與新鮮冰凍肺癌組織總RNA清楚表現(xiàn)的18S和28S條帶相比，F(xiàn)PE肺癌組織的RNA分布廣泛，核酸大小在50～450bps，平均為190bps。在40例PML蛋白無表達的肺癌組織中，均獲得PML mRNA表達。 結(jié)論： 1、組織芯片是分

15、子生物學(xué)研究的可靠工具，具有高通量、省時、快速，同時便于設(shè)計大樣本實驗對照。 2、PML作為重要的腫瘤抑制因子，可能成為SCLC有用的生物標記物，在靶向治療中發(fā)揮作用。 3、這組肺癌中，PML同Survivin、Bcl-2、P16和突變型P53的表達存在相關(guān)性，但未發(fā)現(xiàn)同PML有任何聯(lián)系。 4、利用Trizol一步法從石蠟包埋組織提取的RNA純凈度較高，但是用來擴增的目標基因長度不易超過400bp；肺癌組織中PM