體外不同生長狀態(tài)牛晶狀體上皮細胞對藥物敏感性的差異研究.pdf

1、白內(nèi)障囊外摘除(ECCE)聯(lián)合人工晶體(IOL)植入是目前治療各種白內(nèi)障最有效的手段，但是該手術的并發(fā)癥后發(fā)性白內(nèi)障(PCO)可以嚴重的影響患者的術后視力。晶狀體上皮細胞(BLECs)的增生、分化和凋亡是后發(fā)性白內(nèi)障形成的重要原因之一，因此利用藥物抑制BLECs的增生、分化和凋亡是防治PCO的重要途徑之一。 因為藥物的作用機制不同，因此在眼內(nèi)產(chǎn)生的毒副作用也不同．如抗代謝藥物絲裂酶素在眼內(nèi)除了對殘留的晶狀體上皮細胞有抑制作用以外

2、，還對眼內(nèi)靜止的細胞如角膜內(nèi)皮有毒副作用，因而限制了其在臨床的應用；而一些非抗代謝藥物如地塞米松在眼內(nèi)除了抑制殘留的晶狀體上皮細胞增生以外對其他的靜止的眼內(nèi)細胞沒有毒副作用，因此其在臨床上應用廣泛。研究者一般通過動物實驗來檢驗藥物的毒性作用。但是動物實驗有其缺點：主要是動物個體差異比較大，實驗結果沒有精確性。 因此本實驗設計的目的：在體外，通過用含不同濃度血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)BLECs細胞，使細胞分別處于快速生長狀態(tài)和相對靜止的狀態(tài)

3、，分別模擬術后眼內(nèi)殘留的晶狀體上皮細胞的生長狀態(tài)和角膜內(nèi)皮細胞以及小梁內(nèi)皮細胞的生長狀態(tài)。在體外，使藥物作用于不同生長狀態(tài)的細胞實驗來模擬藥物作用于眼內(nèi)各種細胞的實驗，以彌補動物實驗的不足。 一、實驗方法 1．不同血清濃度對牛晶狀體上皮細胞生長速度的影響 將細胞消化以后，制成單細胞懸濁液，按1：2傳代。分別裝入2個25ml的培養(yǎng)瓶內(nèi)，血清濃度分別為20％和2％。觀察細胞的融合是時間。 2．不同細胞濃度對牛

4、晶狀體上皮細胞生長狀態(tài)的影響 消化細胞，調整細胞濃度為4x104／ml和4x10S／ml。將細胞加入24孔板中，細胞濃度4x104／ml的孔加入含20％FBS的DMEM；細胞濃度4x10S／ml加入含20％FBS的DMEM。每天每種細胞濃度消化兩孔測量A值，共測9天。繪制細胞生長曲線。 3．體外不同生長狀態(tài)牛晶狀體細胞對藥物的敏感性差異實驗-MTT比色法 取對數(shù)生長的牛晶狀體上皮細胞，用0．25％胰蛋白酶和0．0

5、2％EDTA消化制成單細胞懸液，調整細胞濃度為4×104／ml和4×10S／mi接種于24空培養(yǎng)板，每空體積lml,有藥物實驗四組和空白對照組。分別使細胞處于不同的生長狀態(tài)，然后加入實驗藥物。第一組加入含20％FBS的DMEM，細胞貼壁后加入實驗藥物；第二組加／N20％FBS的DMEM，貼壁72小時后加入實驗藥物；第三組2％FBS的DMEM，細胞貼壁后加入實驗藥物；第四組加／N20％FBS的DMEM，貼壁72小時后加入實驗藥物。加入藥物

6、的濃度分別為：5．氟尿嘧啶為25、50、100ug／ml；絲裂酶素為0．25、0．5、lug／mi；肝素為200、400、800u／ml：地塞米松為100、200、400u／ml。各組藥物分別培養(yǎng)48小時后，加／NM'IT培養(yǎng)4小時，棄去培養(yǎng)基，再加入DMS0震蕩15min，在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測吸光度A值。每個濃度設三個空，實驗重復兩次。 二、實驗結果 1．20％IflI清培養(yǎng)組與2％血清培養(yǎng)組之間，牛晶狀體上

7、皮細胞的融合時間有顯著性差異。含20％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的牛晶狀體上皮細胞生長迅速，牛晶狀體上皮細胞生長融合所需要的時間較短。含2％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的牛晶狀體上皮細胞生長緩慢，牛晶狀體上皮細胞生長融合所需要的時間較長。 2．不同細胞濃度對牛晶狀體上皮細胞生長狀態(tài)的影響 20％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的牛晶狀體上皮細胞加入濃度為4x104／ml，在經(jīng)過2-3天的潛伏期后，進入快速生長狀態(tài)，5-8天后基本

8、融合。2％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的牛晶狀體上皮細胞加入的細胞濃度為4×105／ml。細胞基本處于靜止狀態(tài)， 3．同一濃度的5一氟尿嘧啶和絲裂酶素，20％FBS貼壁72h組的抑制率顯著高于其他三組。20％FBS貼壁72h組和20％FBS貼壁組抑制率高于2％FBS貼壁72h組和2％FBS貼壁組的抑制率。各組細胞數(shù)量和對照組有顯著性差異。同一種藥物作用時，隨著藥物濃度增高，抑制率升高。5一氟尿嘧啶和絲裂酶素對于快速生長的細胞和生長

9、緩慢的細胞都有抑制作用并且對于快速生長細胞的抑制率明顯大于生長相對靜止細胞的抑制率。 4．同一濃度的肝素和地塞米松，20％FBS貼壁72h組的抑制率顯著高于其他三組。20％FBS貼壁72h組和20％FBS貼壁組抑制率高于2％FBS貼壁72h組和2％FBS貼壁組的抑制率。20％FBS貼壁72h組和20％FBS貼壁組細胞數(shù)顯著底于對照組；2％FBS貼壁72h組和2％FBS貼壁組細胞數(shù)量和對照組無顯著性差異。隨著藥物濃度增高，20％F

10、BS貼壁72h組和20％FBS貼壁組抑制率升高；2％FBS貼壁72h組和2％FBS貼壁組的抑制率沒有明顯變化。肝素和地塞米松對于快速生長的細胞有抑制作用，對緩慢生長的細胞沒有抑制作用。 三、結論 1．抗代謝藥物對于快速生長的細胞和緩慢生長的細胞都有抑制作用并且對于快速生長細胞抑制率明顯大于緩慢生長細胞的抑制率。非抗代謝藥物對快速生長狀態(tài)細胞有明顯的抑制作用而對緩慢生長的細胞沒有抑制作用。 2．本實驗方法有望成為動