hHO-1基因修飾的豬BMSC旁分泌保護心肌細胞體外缺氧-復氧損傷的初步研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 目前已有多項基礎和臨床研究證實骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)移植可修復受損心肌、顯著改善心肌梗死后心功能，但由于不適應缺血缺氧、炎癥、凋亡因子等惡劣的宿主環(huán)境，移植細胞的90％以上在短期內(nèi)死亡，這大大降低干細胞在心肌損傷修復中的效果，因此，選擇合適的基因?qū)SC進行修飾可能是提高細胞的移植存活率和治療效果的一條有效途徑。
　　 血紅素加氧酶-1(HO-1)參與的保護機制包括減輕內(nèi)毒素、多種細胞炎癥因

2、子、金屬等誘導的氧化應激損傷。其反應終產(chǎn)物CO、膽紅素也被證實具有抗氧化、抗凋亡的作用。這都表明HO-1不僅通過自身反應體系發(fā)揮保護作用，更能借助多種化學信號通路的交互影響產(chǎn)生其他諸如旁分泌細胞因子、保護性信號通路激活、線粒體功能介導等多重保護作用。通過轉(zhuǎn)基因模式獲得一定程度的HO-1過表達，在上述臨床情況下無疑擁有重要的治療前景。
　　 大量前期研究已證實，腺病毒介導hHO-1基因(Ad-hHO-1)心肌內(nèi)注射能有效地抑制心臟

3、缺血-再灌注損傷、減輕缺血性心力衰竭。本課題旨在研究腺病毒介導的HO-1基因修飾對骨髓MSC的抗缺氧存活率以及通過旁分泌作用對體外模擬缺氧/復氧心肌損傷的保護，明確HO-1基因修飾MSC移植治療急性心肌梗死可行性和有效性，為將旁分泌“雞尾酒”療法運用于臨床研究奠定實驗基礎。
　　 方法：
　　 1.采用位點特異性重組(Adeasy)系統(tǒng)，構(gòu)建HO-1重組腺病毒載體。用293細胞擴增、氯化艷密度梯度離心法純化Ad-HO-1

4、，TCID50法測病毒滴度。
　　 2.采用Percoll密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法分離培養(yǎng)MSC。探索并選用最佳感染強度轉(zhuǎn)染BMSC，穩(wěn)定傳代BMSC-HO-1。體外研究轉(zhuǎn)染HO-1基因?qū)δ康牡鞍妆磉_、MSC細胞增殖及多向分化能力的影響。
　　 3.運用TUNEL法體外研究BMSC-HO-1在缺氧、去血清條件下對抗凋亡能力的變化。差速傳代分離培養(yǎng)新生大鼠心肌細胞，換用不同處理下的干細胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察缺氧/

5、復氧過程中的心肌細胞活力變化以及對SAPK/JNK信號通路的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.構(gòu)建hHO-1重組腺病毒載體目的基因測序正確，PCR鑒定排除野毒結(jié)果。在293細胞中大量擴增攜帶hHO-1的重組腺病毒，經(jīng)氯化艷密度梯度超速離心后獲得的病毒滴度約2×1010pfu/ml；
　　 2.Ad-HO-1感染MSC的最佳強度為100pfu/cell，蛋白表達持續(xù)至少13天。hHO-1基因轉(zhuǎn)染對MSC的細胞增殖能力

6、、多向分化潛能無顯著影響。較MSC細胞相比，缺氧-去血清培養(yǎng)24小時后MSC-HO-1的細胞損傷明顯減輕，培養(yǎng)12小時的凋亡指數(shù)顯著降低。
　　 3.缺氧12h時，經(jīng)過缺氧處理后的空白載體修飾干細胞培養(yǎng)基、正常氧濃度以及缺氧處理下的HO-1修飾干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的活力心肌細胞數(shù)較多，且與對照培養(yǎng)基的差異有統(tǒng)計學意義.而復氧2h后，只有缺氧條件下的HO-1修飾干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的活力心肌細胞數(shù)與對照培養(yǎng)基存在統(tǒng)計學意義的差異。復氧、再

7、血清化1h后P-JNK的變化與基線對照組、空白載體組相比均出現(xiàn)統(tǒng)計學意義的降低。
　　 結(jié)論：
　　 1.成熟的病毒載體構(gòu)建、擴增和純化技術(shù)可獲得高滴度、安全、高效的HO-1重組腺病毒載體。
　　 2.腺病毒載體介導HO-1基因可高效轉(zhuǎn)染MSC，穩(wěn)定表達目的基因，持續(xù)時間適中，對MSC的生長增殖及分化能力無明顯影響，是適宜的基因轉(zhuǎn)移載體。
　　 3.HO-1基因轉(zhuǎn)染后的BMSC可以有效對抗缺氧去血清導致的