大鼠晶狀體再生模型中干細胞樣細胞及其相關信號通路的實驗研究.pdf

1、摘要目的：改進大鼠晶狀體再生模型，觀察晶狀體再生過程中干細胞標志物的表達，并初步探討Notch信號通路在晶狀體干細胞樣細胞增殖分化中的作用。方法：。第一部分：大鼠晶狀體再生模型的改進對68周成年健康Wistar大鼠一眼采用透明角膜切口行晶狀體囊外摘除術，術中不采用環(huán)形撕囊，而只將晶狀體前囊膜做騶象限的弧形切開，分離出晶狀體。術后即刻、1天、3天、1周、2周、1月，分別裂隙燈下觀察晶狀體再生情況并照相，HE染色行病理組織學檢查。第二部分：

2、晶狀體再生過程中干細胞標記物的表達及定位1將晶狀體囊外摘除術后3天、1周、2周及1月的晶狀體再生組織分別取出，提取RNA并反轉錄為cDNA，然后通過熒光定量PCR的方法檢測再生組織中干細胞標記物ABCG2、Nestin、PCNA及Telomerase的表達，確定再生晶狀體組織中干細胞樣細胞是否存在。設對側未手術眼為正常對照。2晶狀體囊外摘除術后即刻，將晶狀體囊袋組織分為前囊及后囊(包含赤道部)兩部分，分別提取RNA并通過熒光定量PCR的

3、方法檢測各部分干細胞標記物的表達，初步定位晶狀體干細胞樣細胞。3石蠟包埋的大鼠眼作厚度為4微米的石蠟切片，免疫組化檢測ABCG2及PCNA的表達，對晶狀體干細胞樣細胞進一步定位。4晶狀體囊外摘除術前3天每天兩次注射BrdU，最后一次注射后行一眼的晶狀體囊外摘除術，術后即刻、術后l天、3天及l(fā)周分別取眼球石蠟包埋后切片，通過免疫組化的方法檢測BrdU的表達，確定增殖的細胞所在，輔助定位晶狀體干細胞樣細胞。第三部分：Notch信號通路與晶狀

4、體再生1將晶狀體囊外摘除術后不同時間點的晶狀體再生組織取出，提取RNA并反轉錄為cDNA，然后通過熒光定量PCR的方法檢測Notch信號通路信號分子Notchl、Notch2及Ja91的表達，并且通過對細胞周期調控蛋白CyclinDl的PCR檢測，初步驗證此信號通路是否存在于晶狀體再生過程中。2晶狀體囊外摘除術后即刻、3天及1周，將再生晶狀體組織取出，分別提取組織蛋白，通過Westernblot的方法檢測各部分組織中Notchl、Not

5、ch2及Jagl的表達及變化。結果：及Notch配體Jagl的表達，且晶狀體囊外摘除術后早期表達量呈上升趨勢，術后1周表達量最高，之后逐漸降低。而相應的細胞周期調控關鍵蛋白CyclinDl的表達趨勢與此類似。根據(jù)PCR結果，選取術后l周內的晶狀體再生組織行Westernblot檢測，結果顯示術后即刻即有Notch2的表達，術后3天Notch2表達明顯，術后1周表達降低，而Notchl術后l周表達明顯。Jagl在術后3天開始表達，術后1周

6、表達量明顯。但作為對照的正常晶狀體組織未檢測到各信號分子蛋白的表達。結論：l改進的大鼠晶狀體再生模型短期內即可再生出新的晶狀體組織，且遠離前囊切開的部分再生組織較透明，相應地晶狀體上皮細胞排列較規(guī)則。而前囊切開部分的晶狀體組織明顯混濁，相應晶狀體上皮細胞異常增生，未發(fā)生晶狀體纖維化改變。2正常晶狀體及再生晶狀體組織中均存在干細胞樣細胞，其在晶狀體再生過程中發(fā)揮重要作用。正常的晶狀體組織內僅少量的干細胞樣細胞存在，以維持晶狀體的自我更新；