鑒別豬瘟強(qiáng)毒和弱毒的反轉(zhuǎn)錄-復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的建立.pdf

1、豬瘟(classicalswinefever，CSF)是由豬瘟病毒(classicalswinefevervirus，CSFV)引起豬的一種以稽留高熱、出血、梗死、壞死和高死亡率為主要特征的高度接觸性傳染病。CSFV屬于黃病毒科、瘟病毒屬，該屬還有牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和綿羊邊界病病毒(BDV)。CSFV是一種單股正鏈RNA病毒，基因組長(zhǎng)約為12.3kb，含有唯一的開(kāi)放閱讀框架，編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白(C、E1、E2和Erns)和7種非

2、結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、p7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。CSFV只有一個(gè)血清型，可分為3個(gè)基因群和10個(gè)基因亞群，有研究認(rèn)為基于NS5B基因的分類(lèi)是最可靠的。 本文旨在建立一種能區(qū)分CSFV強(qiáng)毒和弱毒的反轉(zhuǎn)錄-復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-nPCR)檢測(cè)方法。根據(jù)GenBank上登錄的所有CSFV基因組全序列，選擇保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)CSFV通用引物，并在該對(duì)引物跨越區(qū)域的內(nèi)部設(shè)計(jì)了豬瘟兔化弱毒疫苗和強(qiáng)毒特異

3、性引物，建立了一種能區(qū)分豬瘟強(qiáng)毒和弱毒的RT-nPCR鑒別診斷方法。首先用PK-15細(xì)胞對(duì)豬瘟病毒Shimen株、HCLV株和15份黑龍江省采集的疑似豬瘟病料進(jìn)行了病毒分離與繁殖，應(yīng)用該方法從豬瘟兔化弱毒疫苗和Sbimen強(qiáng)毒株基因組中擴(kuò)增出了大小分別為447bp和343bp的一條特異性片段，從兩種病毒基因組混合物中擴(kuò)增出了大小為447bp和343bp的兩條特異性片段，但對(duì)牛病毒性腹瀉病毒和其它常見(jiàn)豬源病毒細(xì)胞培養(yǎng)物以及正常細(xì)胞基因組進(jìn)

4、行檢測(cè)時(shí)均為陰性。該方法可以檢測(cè)出0.04pg的CSFVRNA。并利用該方法對(duì)人工感染的5頭豬全血中的病毒進(jìn)行了檢測(cè)，檢出時(shí)間早，對(duì)人工感染豬最早可于感染后2天檢出；檢測(cè)耗時(shí)短，最快可在6小時(shí)內(nèi)完成。對(duì)從黑龍江省、河南、吉林和其他地區(qū)采集的共41份疑似豬瘟病料進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，有27份類(lèi)似豬瘟強(qiáng)毒，1份類(lèi)似弱毒疫苗。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性和種系發(fā)生分析證實(shí)了RT-nPCR的檢測(cè)結(jié)果。本研究建立的RT-nPCR可以有效區(qū)分豬瘟強(qiáng)毒和弱毒