綠僵菌乙醇脫氫酶1基因功能及其啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、昆蟲(chóng)病原真菌是一類(lèi)重要的，廣泛分布的生防微生物，調(diào)控著生態(tài)系統(tǒng)中昆蟲(chóng)種群的數(shù)量和密度，在自然界中扮演重要的角色。昆蟲(chóng)病原真菌作為殺蟲(chóng)微生物農(nóng)藥，具有對(duì)環(huán)境安全、人畜無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是替代化學(xué)農(nóng)藥的理想產(chǎn)品，但其致死時(shí)間長(zhǎng)、生產(chǎn)成本高、對(duì)環(huán)境敏感等缺點(diǎn)限制了昆蟲(chóng)病原真菌的大規(guī)模應(yīng)用。因此研究昆蟲(chóng)病原真菌的侵染致病、產(chǎn)孢和抗逆境機(jī)制對(duì)生物防治具有十分重要的意義。
　　昆蟲(chóng)病原真菌在自然界中廣泛分布，從北極到熱帶，從高原到平原，從沼澤

2、到沙漠均有分布，因此其必然面臨各種各樣的環(huán)境壓力如高滲、溫度、紫外、氧等。乙醇脫氫酶在動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌中廣泛存在，轉(zhuǎn)錄組分析表明乙醇脫氫酶1（MaADH1）在蝗綠僵菌（Metarhizium acridum）產(chǎn)孢時(shí)期高表達(dá)，表達(dá)模式分析表明MaADH1在產(chǎn)孢時(shí)期高表達(dá)，而在其他時(shí)期表達(dá)量很低或不表達(dá)。因此采用基因敲除的方法對(duì)MaADH1基因在蝗綠僵菌中的功能及其啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行了分析。
　　主要研究結(jié)果如下：
　

3、　1.MaADH1的克隆及功能分析
　　1.1.MaADH1的克隆與序列分析
　　根據(jù)已知的蝗綠僵菌全基因組序列和cDNA序列，克隆得到了MaADH1序列，其登錄號(hào)為XM_007811707.1。分析得知 MaADH1序列全長(zhǎng)為1131 bp，MaADH1 cDNA ORF全長(zhǎng)為1059 bp，編碼353個(gè)氨基酸，其中包含一個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)度為69 bp；保守結(jié)構(gòu)域分析表明MaADH1含有3個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域即鋅指結(jié)構(gòu)、NADP結(jié)合位

4、點(diǎn)、底物催化活性位點(diǎn)，具有ADH1的結(jié)構(gòu)特征。
　　1.2.MaADH1敲除和回復(fù)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證
　　為了分析MaADH1基因的功能，采用基因重組的方法構(gòu)建了ADH1敲除和回復(fù)載體，并轉(zhuǎn)化綠僵菌，通過(guò)PCR篩選MaADH1敲除菌株和回復(fù)菌株并Southern雜交驗(yàn)證各轉(zhuǎn)化子的正確性。最終獲得正確的MaADH1敲除菌株和回復(fù)菌株。
　　1.3.MaADH1基因表達(dá)模式分析
　　半定量PCR和RT-PCR分析結(jié)果表

5、明MaADH1在產(chǎn)孢時(shí)期高表達(dá)，而在菌絲，附著胞和蟲(chóng)菌體時(shí)期表達(dá)量較低。
　　1.4.低氧條件下MaADH1基因?qū)染G僵菌生物量的影響
　　在低氧條件下，ΔMaADH1的生物量顯著低于WT和CP，其生物量?jī)H為WT和CP菌株的50％,在正常條件下，ΔMaADH1的生物量與WT和CP相比無(wú)顯著差異。
　　1.5.低氧條件下MaADH1調(diào)控綠僵菌產(chǎn)孢
　　在低氧條件下對(duì)綠僵菌在固體大米和液體1/4SDAY培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢

6、量進(jìn)行了分析。結(jié)果表明無(wú)論是固體發(fā)酵還是液體發(fā)酵ΔMaADH1菌株的產(chǎn)孢量均顯著低于WT和CP；在固體發(fā)酵中，ΔMaADH1在低氧條件下產(chǎn)孢量?jī)H為正常條件下的48%，在固體發(fā)酵中ΔMaADH1產(chǎn)孢量較低，主要以菌絲形式存在。
　　1.6.低氧條件下MaADH1基因的表達(dá)量及溶氧量分析
　　在低氧條件下，ΔMaADH1菌株所在液體培養(yǎng)基中的溶氧量與WT和CP相比無(wú)顯著差異；RT-PCR分析結(jié)果表明在低氧條件下 MaADH1基因

7、的表達(dá)量顯著高于正常溶氧條件下MaADH1基因的表達(dá)量。
　　1.7.低氧條件下MaADH1酶比活性測(cè)定
　　通過(guò)酶學(xué)活性分析表明，在低氧條件下乙醇脫氫酶1的活性顯著高于正常溶氧條件下乙醇脫氫酶1的活性，其結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致。
　　1.8.低氧條件下培養(yǎng)基中乙醇和乙醛含量測(cè)定及耐受性分析
　　在低氧條件下分析了WT、ΔMaADH1和CP菌株在液體培養(yǎng)基中乙醇和乙醛含量的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明在低氧條件下隨著時(shí)

8、間的延長(zhǎng)，乙醇和乙醛含量逐漸增多，但ΔMaADH1中乙醇含量顯著低于WT和CP，然而ΔMaADH1中乙醛含量顯著高于WT和CP；耐受性分析表明WT，ΔMaADH1，和CP菌株對(duì)乙醛的耐受性顯著低于對(duì)乙醇的耐受性。
　　1.9.乙醛影響菌絲的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢
　　為了分析乙醛對(duì)綠僵菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響，在培養(yǎng)基中加入不同濃度的乙醛，結(jié)果表明當(dāng)培養(yǎng)基中乙醛含量達(dá)到0.01%濃度時(shí)就能抑制綠僵菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，并且ΔMaADH1菌株的生長(zhǎng)和

9、產(chǎn)孢量顯著低于WT和CP。
　　2．PMaADH1的結(jié)構(gòu)與功能研究
　　2.1.PMaADH1生物信息學(xué)分析結(jié)果
　　根據(jù)ADH1基因在蝗綠僵菌基因中的位置，克隆MaADH1上游3246 bp的序列，命名為 PMaADH1。并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明起始密碼子上游163 bp為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；PMaADH1含有一些保守的調(diào)節(jié)元件，如 TATA-box, CAAT-box和CT富集區(qū)；MaADH1的上游區(qū)域內(nèi)存在一

10、些ADH1啟動(dòng)子的保守序列。在PMaADH1保守序列及其它區(qū)域存在大量正、反向重復(fù)序列。
　　2.2.轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證結(jié)果
　　根據(jù)PMaADH1功能元件的位置，克隆不同長(zhǎng)度（3246 bp，2702 bp，2448 bp，2219 bp，1670 bp,1138 bp,521 bp,226 bp）的PMaADH15'缺失片段，與EGFP基因片段融合插入pK2-Sur載體，并共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化綠僵菌。對(duì)初篩轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR和Souther

11、n blot驗(yàn)證, Southern blot結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化子中PMaADH1的拷貝數(shù)為1到2個(gè)，大部分為單拷貝。
　　2.3.PMaADH1缺失突變分析
　　qRT-PCR分析結(jié)果表明缺失了-3246 bp至-2702 bp區(qū)域的Del1對(duì)EGFP的啟動(dòng)活性沒(méi)有顯著影響，表明該區(qū)域?qū)?dòng)子來(lái)說(shuō)不是必需的；而進(jìn)一步缺失-2702 bp到-2448 bp區(qū)域的Del2啟動(dòng)子活性顯著增強(qiáng)，增強(qiáng)了約20%，說(shuō)明在此區(qū)域存在反式作用

12、元件；而當(dāng)缺失-2448 bp到-2219區(qū)域的Del3啟動(dòng)子的活性下調(diào)了15%,說(shuō)明該區(qū)域存在重要的順式作用元件；缺失-2219 bp到-1690 bp區(qū)域的Del4，啟動(dòng)子活性增強(qiáng)了15%說(shuō)明在此區(qū)域存在反式作用元件；當(dāng)缺失了-1690 bp到-1138 bp區(qū)域的Del5啟動(dòng)子活性下降了20%，表明該區(qū)域存在重要的順式作用元件，但當(dāng)缺失-1138 bp到-521 bp區(qū)域時(shí)，Del6的活性下降了99.7%，說(shuō)明此區(qū)域?qū)?dòng)子的活性

13、是至關(guān)重要的；缺失-521 bp到-226 bp區(qū)域即Del7基本檢測(cè)不到信號(hào)。
　　2.4.PMaADH1特異表達(dá)Mcl1顯著提高蝗綠僵菌毒力
　　用活性較強(qiáng)的Del3啟動(dòng)子特異表達(dá)膠原蛋白（Mcl1）,體內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與WT相比轉(zhuǎn)化子毒力顯著增強(qiáng)，LT50提前0.8天。
　　綜上所述，在低氧條件下MaADH1通過(guò)乙醛代謝來(lái)調(diào)控蝗綠僵菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，MaADH1基因在孢子時(shí)期特異高表達(dá)，啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)與功能研究表明M