FGFR3在小鼠成年期骨重建和骨折愈合中的作用和機制研究.pdf

1、成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptors，F(xiàn)GFRs)屬于受體酪氨酸蛋白激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)家族，它們通過與成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GFs)結(jié)合發(fā)揮生物學功能。FGFs/FGFRs作用廣泛，近年來大量研究發(fā)現(xiàn)FGF信號與骨骼發(fā)育及疾病也有密切關(guān)系。 骨骼形成主要通過軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨兩

2、種方式來完成。其中骨組織形成的基本過程一致，即間充質(zhì)干細胞增殖和密集后分化為成骨細胞，成骨細胞分泌類骨質(zhì)，并被包埋其中，成為骨細胞，繼而類骨質(zhì)鈣化成骨基質(zhì)，最后形成骨組織。在成年期，骨骼正常結(jié)構(gòu)和功能的維持主要通過骨重建(remodeling)來實現(xiàn)。 FGFR3是FGFRs家族成員之一，它是骨骼生長的負性調(diào)節(jié)分子。在人體中FGFR3的功能增強型點突變主要引起軟骨發(fā)育不全(achondroplasia，ACH)、季肋發(fā)育不全(

3、hypochondroplasia，HCH)和致死性骨發(fā)育不全(thanatophoric dysplasia.TD)等三種軟骨發(fā)育不良性疾病。既往對FGFR3在軟骨發(fā)育中的作用研究較多，但對其在骨形成，特別是成年期骨重建中的作用和相關(guān)機制缺乏深入的了解和分析。 人類FGFR3 A391E等功能增強型點突變可引起囟門早閉，提示FGFR3對骨形成可能有直接調(diào)節(jié)作用。成年期FGFR3敲除小鼠骨質(zhì)減少，礦化缺陷，進一步提示FGFR3可

4、調(diào)節(jié)成骨并能影響成年期骨重建，但具體機制不明。此外，模擬人類軟骨發(fā)育不全的FGFR3功能增強型點突變小鼠除軟骨發(fā)育異常外，出生早期生長板處即有Cbfal、OP和OC等成骨標志基因表達上調(diào)，并伴有骨領(lǐng)提前發(fā)生和骨小梁短少，這時有關(guān)骨形成的變化和早期軟骨形成障礙還有一定的聯(lián)系，但其成年后骨骼是否還有改變尚不清楚，需要進一步研究。 骨折愈合過程是骨骼局部的再發(fā)育過程，很多調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育的分子也都調(diào)節(jié)骨折愈合過程。大量研究表明FGFs參與

5、骨折愈合，而FGFs又通過FGFRs發(fā)揮作用。如前所述，F(xiàn)GFR3是體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育的分子，提示它可能參與調(diào)節(jié)骨折愈合過程，但它對骨折愈合的具體作用和機制有待進一步闡明。 據(jù)此，本課題利用野生型和FGFR3功能增強型點突變(FGFR3G369C/+)小鼠(模擬人ACH疾病)，從影響骨重建和骨折愈合的多種因素入手，探討了FGFR3在成年期骨重建和骨折愈合中的作用和機制。 主要實驗方法： 第一部分：FGFR3在

6、小鼠成年期骨重建中的作用和機制研究 1、利用X線攝片、雙能骨密度計和Micro CT觀察成年小鼠股骨骨密度及骨組織結(jié)構(gòu)的變化。用三點折斷法檢測其生物力學特性。 2、通過HE、Masson三色染色和鈣綠素雙標實驗觀察小鼠脛骨骨小梁的結(jié)構(gòu)及礦化情況。測定血清鈣磷含量，了解體內(nèi)鈣磷代謝是否與骨骼礦化有關(guān)。定量PCR檢測成骨細胞分化標志基因OC、OP和成骨相關(guān)基因FGFRI、FGFR2和BMPRIA的表達。 3、小鼠骨髓

7、基質(zhì)細胞分離培養(yǎng)，測定生長曲線并進行成骨誘導。通過堿性磷酸酶、茜素紅染色觀察，結(jié)合成骨相關(guān)基因的表達，觀察成骨分化和礦化情況，并用Western Blot檢測其Erkl/2磷酸化水平。 4、通過TRAP染色觀察脛骨破骨細胞形成情況，定量PCR檢測破骨細胞相關(guān)基因TRAP、Ctsk和MMP9的表達變化。 5、體外進行破骨細胞誘導分化，通過TRAP染色、骨吸收實驗和破骨細胞相關(guān)基因表達的檢測，研究破骨細胞的分化及骨吸收功能。

8、Western Blot檢測破骨細胞中Erkl/2磷酸化水平。 第二部分：FGFR3在小鼠骨折愈合中的作用和機制研究 1、用原位雜交方法檢測FGFR3 mRNA在骨折愈合各階段骨痂中的表達。 2、利用X線攝片和藏紅固綠染色觀察骨折愈合情況。生物力學實驗檢測骨折21天后脛骨的機械性能。 3、利用原位雜交和藏紅固綠染色，結(jié)合骨痂中軟骨細胞分化相關(guān)基因COL2AI、COLIOA1、IHH和SOX9的mRNA變化

9、觀察軟骨分化情況。通過體外骨髓基質(zhì)細胞向軟骨細胞誘導分化實驗進一步驗證上述在體實驗的結(jié)果。 4、通過骨痂組織TRAP染色，結(jié)合TRAP mRNA表達檢測，觀察破骨細胞形成情況。 主要實驗結(jié)果： 一、FGFR3G369C/+小鼠成年期骨量減少，骨重建異常 1、FGFR3G369a+小鼠成年后骨量減少，骨皮質(zhì)生物力學性能改變 2月和4月齡的FGFR3G369C/+小鼠股骨骨密度降低，骨小梁數(shù)量減少，分

10、離度降低；骨皮質(zhì)厚度無明顯改變，但反映其生物力學特性的最大值彎曲載荷和彈性模量均增加。 2、FGFR3G369C/+小鼠成骨細胞分化增強、礦化降低 (1)2月齡FGFR3G369C/+小鼠脛骨骨小梁稀疏。骨小梁表面成骨細胞胞體增大，伴有類骨質(zhì)增多，礦物質(zhì)沉積率降低，提示該小鼠成骨細胞雖然分泌基質(zhì)的功能活躍，但胞外基質(zhì)礦化能力可能存在缺陷，而體內(nèi)血清鈣磷含量正常，提示骨骼礦化障礙是由成骨細胞本身功能異常引起的。骨組織中成骨

11、細胞分化標志基因OP表達增加；成骨相關(guān)基因FGFR1和BMPRIA表達上調(diào)，F(xiàn)GFR2表達下降。 (2) FGFR3G369C/+小鼠骨髓基質(zhì)細胞增生減慢，向成骨細胞分化過程中堿性磷酸酶表達增加，鈣結(jié)節(jié)形成減少，成骨細胞分化標志基因Cbfal、OP和OC表達均顯著上調(diào)，表明成骨細胞分化增強，礦化降低。此外，F(xiàn)GFR3G369C/+小鼠骨髓基質(zhì)細胞中Erkl/2磷酸化蛋白水平明顯增加，提示FGFR3G369C/+小鼠成骨和礦化能力

12、的改變可能是由Erkl/2信號途徑活化引起的。 3、FGFR3G369C/+小鼠破骨細胞分化和骨吸收功能增加 (1) FGFR3G369C/+小鼠脛骨生長板處破骨細胞數(shù)量增加，骨小梁表面吸收陷窩變深；骨組織中破骨細胞功能相關(guān)基因TRAP和Ctsk表達明顯增加，MMP9則無改變。結(jié)果提示FGFR3G369C/+小鼠破骨細胞形成和骨吸收功能增加。 (2) FGFR3G369C/+小鼠體外誘導的破骨細胞形成數(shù)量及骨片上

13、吸收陷窩面積都明顯增加，破骨細胞功能相關(guān)基因TRAP和MMP9表達顯著上調(diào)，Ctsk表達沒有改變。破骨細胞Erkl/2蛋白磷酸化水平升高，提示FGFR3可能通過激活Erkl/2通路促進了破骨細胞形成和骨吸收功能。 二、FGFR3G369C/+小鼠骨折愈合延遲 1.FGFR3在骨折后7天、14天和21天骨痂的增生、肥大前和肥大軟骨細胞中都表達，提示FGFR3可能參與調(diào)節(jié)骨折愈合過程。 2.FGFR3G369C/+小

14、鼠脛骨骨折后21天，骨痂中仍有軟骨殘留，并且其最大值彎曲載荷減少，說明該小鼠骨折愈合延遲，并且骨折后脛骨的機械性能下降。 3.FGFR3G369C/+小鼠骨痂軟骨細胞分化降低 (1) FGFR3G369C/+小鼠骨痂處增生軟骨細胞標志基因COL2A1和肥大軟骨細胞標志基因COL10A1分別在骨折后3天和7天時表達滯后或下降；骨折后10和14天，F(xiàn)GFR3G369C/+小鼠骨痂中肥大軟骨細胞較少，但增生軟骨細胞和不成熟的間

15、充質(zhì)細胞較多；軟骨分化相關(guān)基因SOX9和IHH表達降低。結(jié)果提示FGFR3G369C/+小鼠骨痂軟骨細胞分化受到抑制。 (2) FGFR3G369C/+小鼠骨髓基質(zhì)細胞向軟骨分化過程中COL2A1和SOX9表達下降，提示體外軟骨細胞分化減慢。 4、FGFR3G369C/+小鼠骨痂破骨細胞形成異常 骨折后10天和14天，F(xiàn)GFR3G369a+小鼠骨痂破骨細胞形成明顯減少，但骨折后21天破骨細胞形成增加。 主

16、要結(jié)論： 1、FGFR3功能增強點突變小鼠成年期骨量下降由其成骨作用改變及破骨細胞功能增強共同引起。 2、FGFR3功能增強抑制骨髓基質(zhì)細胞增生；促進Cbfal表達，繼而上調(diào)OP和OC表達水平促進其向成骨細胞分化，抑制礦化。這一作用可能部分是通過激活Erkl/2信號通路實現(xiàn)的。 3、FGFR3功能增強后可能通過激活破骨細胞中Erkl/2信號通路，上調(diào)TRAP和Ctsk表達水平，從而促進破骨細胞分化及骨吸收功能。