大黃對膿毒癥大鼠干預作用的研究.pdf

1、目的:膿毒癥是對人類健康、經(jīng)濟生活、社會生活造成嚴重威脅的疾病之一。眾多學者對膿毒癥所致多器官損傷的機制已有廣泛研究,如:肺臟、心臟、肝臟、腎臟、脾臟、腦等,但對于消化系統(tǒng)的鮮有報道。胃腸道不僅是食物消化吸收的場所,更是人體內(nèi)的細菌庫,近些年逐漸認識到在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中胃腸道所發(fā)揮的重要作用,小腸作為機體膿毒癥的始動器官[1-2],更是成為新的治療靶點。二胺氧化酶(diamineoxidase,DAO)存在于哺乳動物的粘膜和絨毛上層,

2、大部分存在于小腸粘膜絨毛,極少部分存在于子宮內(nèi)膜絨毛。是具有高度活性的細胞內(nèi)酶,是反映小腸粘膜功能及結(jié)構(gòu)完整性的較為理想的指標。通過測定血清和小腸組織中DAO活性變化,來反映小腸粘膜屏障的功能,尤其可在無創(chuàng)情況下測定血清DAO活性來反映腸道的損傷及其修復情況。大黃被認為在治療全身炎癥反應(yīng)綜合癥(systemicinflammatoryresponsesyndrome,SIRS)及多器官功能障礙綜合征(multipleorgandysfu

3、nctionsyndrome,MODS)等方面有明顯效果[3]。本研究旨在通過測定各組膿毒癥大鼠血清DAO水平、腸組織勻漿DAO水平及血清TNF-α來揭示大黃對膿毒癥大鼠發(fā)揮保護作用之機制、療效。以期指導臨床用藥,降低膿毒癥患者的死亡率、改善膿毒癥患者的預后、減少膿毒癥患者的經(jīng)濟負擔。
　　 方法:實驗動物分組:成年、健康SD大鼠84只,購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心(合格證編號1303144),雌雄各半,按隨機數(shù)字法分為五組,分

4、別是Ⅰ空白組6只、Ⅱ假手術(shù)組6只(對照組)、Ⅲ盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)組24只、Ⅳ大黃治療組24只、Ⅴ烏司他丁治療組24只。又將Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組經(jīng)隨機數(shù)字表法分為四個時相組,盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)后6h、CLP后12h、CLP后24h、CLP后48h、每時相組6只。
　　 實驗前準備:將各組大鼠于實驗前分別稱重,并按大鼠編號分別記錄。大鼠盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)模型制備:實驗室溫度控制在24～26℃,濕度在35～45％。將麻醉好的大鼠固

5、定于試驗臺上,取大鼠仰臥位,75％酒精消毒腹部備皮區(qū),在無菌狀態(tài)下行腹部正中切口,約1.5cm,逐層打開腹腔,探尋盲腸并將其拉出腹腔。小心游離盲腸末端腸系膜(一定要避免出血,否則極易縮短大鼠復蘇后的生存時間),將盲腸內(nèi)糞便輕輕推入直腸內(nèi)(同一批鼠,要保證盲腸結(jié)扎端內(nèi)糞便殘余量基本一致,確保實驗大鼠膿毒癥的一致性),距離回盲部1.5cm處用4號絲線,避開盲腸動、靜脈,在血管弓內(nèi)側(cè)結(jié)扎(保證每只大鼠被結(jié)扎的盲腸長度基本一致),結(jié)扎完畢仔細檢

6、查,保持腸道通路正常。以18號針頭在距離回盲部1cm處穿刺3次,可見少量腸內(nèi)容物流出。將盲腸還納入腹,逐層關(guān)腹。術(shù)畢,皮下注射生理鹽水3ml/100g補充體液丟失。術(shù)后暖燈照射下復蘇1.5～2h左右,大鼠蘇醒,可自由進食飲水。以術(shù)后大鼠出現(xiàn)精神倦怠、少動、寒戰(zhàn)、腹脹、眼角分泌物增多、豎毛,測肛溫＜34℃,處死后可見腹腔有血性滲液,盲腸腫脹、變黑、粘連,空腸腸管脹氣等表現(xiàn),確定膿毒癥造模成功。
　　 標本采集與保存:采取眼球取血法

7、采血4ml,并將其置于普通塑料試管中,靜置約30min,待其自然凝固,析出血清,以3000轉(zhuǎn)/min離心10min,然后取上層血清約1.5ml,移至Eppendorf管中,-70℃冰箱保存待用。開腹,距回盲部10cm處留取小腸組織5cm,將其縱行剖開,于冰生理鹽水漂洗,除去血液、腸道內(nèi)容物,濾紙吸干,稱取1g小腸組織,置于10ml的小燒杯,加入0.86％冰冷生理鹽水6ml剪碎組織后倒入玻璃勻漿器,再用3ml冰生理鹽水沖洗殘留組織,一起倒

8、入勻漿管中,充分研碎,以制成10％組織勻漿,置于4℃離心機中,以12000r/min離心12分鐘,然后用移液器取上層勻漿液約1.5ml,移至Eppendorf管中,-70℃冰箱保存待用。
　　 指標檢測:采用ELISA雙夾心抗體法,分別檢測每組大鼠四個時相組血清TNF-α、DAO及腸組織勻漿DAO含量。
　　 統(tǒng)計方法:所有數(shù)據(jù)采用(x)±s表示。用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)處理,采用方差分析和獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計學

9、分析,以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:1.血清二胺氧化酶(DAO)濃度分析
　　 模型組血清DAO含量總體高于假手術(shù)組(P＜0.05);模型組血清DAO含量造模后時間變量影響,24h組、48h組與6h組、12h組有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01),于6h開始升高,12h內(nèi)持續(xù)升高,于24h達高峰,48h維持在較高水平。
　　 大黃治療組、烏司他丁組6h、12h血清DAO濃度與模型組相比無統(tǒng)計學差異(P＞

10、0.05);大黃治療組、烏司他丁組24h、48h組DAO濃度與模型組相比顯著降低有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。兩治療組各時間點血清二胺氧化酶(DAO)濃度相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 2.腸勻漿DAO濃度分析
　　 各組各時間點腸勻漿二胺氧化酶(DAO)濃度相比均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 3.血清TNF-α濃度分析
　　 血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)濃度在造模后6h達高峰(5

11、7.6±7.9),12h濃度降低(49.4±2.8),有統(tǒng)計學差異(P＜0.05),24h濃度明顯降低(23.3±3.1),有統(tǒng)計學差異(P＜0.01),48h保持在較低水平(28.6±6.4)。大黃治療組、烏司他丁組各時間點血清TNF-α濃度與模型組相比,6h組明顯降低,有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01),12h組仍明顯降低,有統(tǒng)計學差異(P＜0.05),24h組、48h組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。大黃治療組與烏司他丁組各時間點血清

12、TNF-α濃度相比無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。
　　 結(jié)論:1.大鼠盲腸結(jié)扎穿孔后血清DAO水平于6h開始升高,12h內(nèi)持續(xù)升高,24h達高峰,48h維持在較高水平。
　　 2.大鼠盲腸結(jié)扎穿孔后血清TNF-α水平于6h達高峰,12h開始回落,24h后明顯下降落,48h保持在一個較低的水平。
　　 3.大鼠盲腸結(jié)扎穿孔后腸勻漿DAO水平于各組均無變化。
　　 4.大黃及UTI可以顯著降低大鼠盲腸結(jié)扎穿孔