腫瘤相關成纖維細胞自噬調控對大腸癌放射敏感性的影響及其機制研究.pdf

1、目的:研究調控腫瘤相關成纖維細胞(CAFs)的自噬狀態(tài)對共培養(yǎng)大腸癌細胞放射敏感性的影響并探討其可能機制，為大腸癌的放射增敏研究提供新的思路;通過觀察自噬調控預處理的腫瘤相關成纖維細胞(CAFs)與大腸癌細胞混合接種小鼠的成瘤情況及移植瘤的放射敏感性，初步探索通過調控CAFs自噬狀態(tài)提高腫瘤放射治療效果的可能性。
　　方法:（一）取新鮮直腸癌組織手術標本，進行組織塊培養(yǎng)，反復傳代純化，獲取CAFs;取大腸癌患者正常大腸粘膜原代培養(yǎng)

2、獲取正常成纖維細胞(CNFs)，并將其與大腸癌CCL224細胞共培養(yǎng)誘導生成CAFs;對CNFs及兩種方法獲取的CAFs進行形態(tài)學觀察，并以α-SMA、vimentin及CK18、SDF-1單抗進行熒光免疫檢測鑒定;（二）以MDC自噬囊泡染色法、LC3免疫熒光法比較CNFs與CAFs自噬狀態(tài);篩選自噬上調劑雷帕霉素與自噬抑制巴弗洛霉素的最佳作用時間與劑量，分別對CAFs進行自噬調控，以MDC法、LC3免疫熒光法及自噬相關蛋白Wester

3、n blot法進行自噬調控效果比較;設立對照組（CAFs+大腸癌細胞組）、自噬上調組（雷帕霉素預處理CAFs+大腸癌細胞組）及自噬下調組（巴弗洛霉素預處理CAFs+大腸癌細胞），觀察不同CAFs自噬狀態(tài)對大腸癌侵襲與遷移能力對影響;通過觀察0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy照射后大腸癌細胞克隆形成能力、細胞凋亡等方法觀察經自噬調控的CAFs對共培養(yǎng)大腸癌細胞放射敏感性的影響;并通過對腫瘤細胞γH2AX焦點計數(shù)以及P53、Bcl-2、

4、Bax、caspase-3、NFkB等蛋白的檢測與CAFs培養(yǎng)液中乳酸含量的檢測，分析經自噬調控CAFs影響大腸癌放射敏感性的可能機制;（三）利用雷帕霉素與巴弗洛霉素分別對CAFs進行自噬上調與下調，按照3∶1的比例與HCT116及CCL224大腸癌細胞混合接種于BALB/c裸鼠，分腫瘤細胞單獨接種組、CAFs+腫瘤混合接種組、自噬上調CAFs+腫瘤混合接種組、自噬下調CAFs+腫瘤混合接種組，每組含HCT116及CCL224亞組，每亞

5、組6只小鼠。觀察各種成瘤率、成瘤時間，瘤體體積變化與小鼠體重改變，并對成瘤小鼠進行局部外照射，比較各組受照后小鼠體重與瘤體體積變化及照后7d瘤體重量，并通過HE染色、免疫組化及Western blot等方法觀察照后病理改變及相關蛋白表達變化。
　　結果:（一）利用直腸癌組織直接原代培養(yǎng)法或大腸粘膜原代培養(yǎng)獲取CNFs與腸癌細胞HCT116及CCL224共培養(yǎng)誘導法，均可可獲得α-SMA(+) SDF-1(+)vimentin(+)

6、CK18(-)的具有典型CAFs特征的肌成纖維細胞;（二）活化的CAFs細胞比CNFs具有更高的自噬水平;400nM雷帕霉素可進一步增加CAFs自噬，Western blot檢測顯示DRAM、Atg5及Beclin-1、LC3等自噬相關基因表達上調，而400nM巴弗洛霉素可抑制CAFs自噬水平，DRAM、Atg5與Beclin-1基因表達下調;不同CAFs自噬狀態(tài)對大腸癌CCL224侵襲與遷移能力產生影響，自噬上調組大腸癌細胞遷移能力最

7、強，自噬下調組遷移能力最弱，在侵襲實驗中，自噬上調組穿出細胞數(shù)最多，而自噬下調組穿出細胞數(shù)最少;經不同劑量照射后CCL224細胞與不同自噬狀態(tài)CAFs共培養(yǎng)，克隆形成實驗顯示自噬上調組克隆形成數(shù)最多，自噬下調組克隆數(shù)最少;4Gy照射后，對照組大腸癌細胞凋亡率為36.62％，自噬上調組的細胞凋亡率為21.56％，與其他兩種具有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)，而自噬下調組腫瘤細胞凋亡率為47.47％，與其他兩組具有顯著性差異(p＜0.01);γ

8、H2AX焦點計數(shù)實驗發(fā)現(xiàn)照射后4h及16h時，自噬下調組焦點計數(shù)明顯多于其他兩組;CAFs自噬改變，對凋亡相關基因的表達也產生顯著影響，自噬上調組的Bcl-2、NFκB基因表達上調，而Bax、P53及caspase-3表達下調，自噬下調組為Bcl-2與NFκB表達下調，而Bax、P53、caspase-3表達上調;不同自噬水平CAFs的培養(yǎng)液中，乳酸含量明顯不同，以自噬上調組濃度最高，自噬下調組濃度最低;（三）1×106個HCT116及

9、CCL224細胞單獨接種，小鼠成瘤率極低，而與CAFs混合接種后全部小鼠成瘤，不受CAFs自噬狀態(tài)影響;CAFs自噬未調控組腫瘤體積最大、瘤體最重，自噬上調組Ki67表達最強，而自噬下調組腫瘤最小，瘤體最輕，Ki67、α-SMA及Glut-1表達最少，HCT116細胞移植瘤與CCL224細胞移植瘤中，自噬相關蛋白表達缺乏一致性，自噬上調似可增加組織Beclin-1與caspase-3的表達。
　　結論:直腸癌直接原代培養(yǎng)法或利用原

10、代培養(yǎng)CNFs與腫瘤細胞混合培養(yǎng)的活化誘導法，均可獲取具有典型表型與特征的CAFs，CAFs比CNFs具有更高的自噬水平;上調CAFs自噬水平，可降低共培養(yǎng)大腸癌細胞的放射敏感性，而抑制CAFs自噬，可增加共培養(yǎng)大腸癌細胞的放射敏感性;CAFs自噬調控對大腸癌放射敏感性的改變，可能與乳酸含量、促增殖/凋亡相關基因表達以及DNA損傷修復能力的變化有關。無論是否接受自噬調控預處理，CAFs均具有明顯促腫瘤成瘤作用。CAFs自噬，可能是腫瘤放