三氧化二砷及其中間代謝產物引起白血病NB4細胞自噬的相關研究.pdf

1、目的:
　　以急性早幼粒性白血病細胞株NB4為研究對象,探討亞砷酸鈉及其中間代謝產物單甲基亞砷酸(MMAⅢ)、二甲基亞砷酸(DMAⅢ)作用于NB4細胞后與自噬的關系,進一步研究其作用機理。
　　方法:
　　常規(guī)培養(yǎng)NB4細胞,取生長良好、狀態(tài)一致的NB4細胞,隨機分為四組(Con組,iAsⅢ組,MMAⅢ組,DMAⅢ組),加入濃度為1μM的對應三種砷化合物,處理不同時間后,透射電鏡、Western-blot和免疫熒光等方

2、法檢測不同砷化合物對NB4細胞作用與自噬的關系。Western-blot法檢測自噬相關蛋白表達。
　　結果:
　　前期研究結果中MTT結果顯示,三種砷化合物(iAsⅢ,MMAⅢ和DMAⅢ)中,二甲基中間代謝產物DMAⅢ對NB4細胞的毒性最大,其次為一甲基中間代謝產物MMAⅢ,iAsⅢ對NB4細胞的毒性最小。前期研究顯示iAsⅢ可以降解急性早幼粒細胞性白血病(Acute Promyeloid Leukaemia,APL)特異性

3、融合蛋白PML/RARα,誘導細胞分化成正常細胞;單甲基代謝產物MMAⅢ及二甲基代謝產物DMAⅢ處理NB4細胞后,未能降解融合蛋白PML/RARα,而是誘導細胞產生凋亡。
　　前期研究結果顯示砷中間代謝產物MMAⅢ通過作用于線粒體引起細胞凋亡,而DMAⅢ通過內質網應激引起細胞凋亡。當加入凋亡抑制劑后,發(fā)現并不能完全逆轉兩種代謝產物引起的細胞凋亡,提示我們除了線粒體與內質網途徑引起的凋亡以外,還可能存在另外一種凋亡方式誘導細胞凋亡。

4、細胞在受到刺激后可以發(fā)生自噬性凋亡,因此我們推測砷中間代謝產物可能誘導細胞發(fā)生了自噬性凋亡。有文獻報道[1],iAsⅢ處理NB4細胞后,通過自噬途徑降解PML/RARα融合蛋白。透射電鏡結果顯示,經亞砷酸鈉及其代謝產物處理NB4細胞后,均可見明顯的自噬泡。Western-blot檢測自噬相關蛋白LC3B及Beclin-1,經iAsⅢ處理的NB4細胞均有顯著表達,而MMAⅢ及DMAⅢ處理過NB4細胞后,自噬相關蛋白出現一過性顯著表達,兩者

5、之間有顯著性差異。共聚焦顯微鏡觀察結果顯示,對照組LC3B與PML沒有良好重疊,而iAsⅢ處理后LC3B與PML有良好的重疊;MMAⅢ及DMAⅢ處理過NB4細胞后,LC3B與PML也沒有良好重疊。由此提示iAsⅢ處理NB4細胞后發(fā)生了自噬現象,而MMAШ及DMAⅢ處理后雖然發(fā)生了自噬現象,但不能降解融合蛋白。
　　為了研究三種不同砷化合物作用NB4細胞后發(fā)生自噬的相關機制,我們探討了自噬通路相關蛋白p-Akt473、p-mTOR的

6、表達,結果顯示經過iAsⅢ處理NB4細胞后P-Akt473表達量一過性升高,p-mTOR12 h后明顯下調;MMAⅢ作用于NB4細胞后,p-Akt473表達量呈現時間依賴性減少, p-mTOR12 h后明顯下調;DMAⅢ作用于NB4后,P-Akt473表達量一過性升高,p-mTOR24 h后明顯下調。結果提示,iAsⅢ、MMAⅢ及DMAⅢ誘導細胞自噬均與p-Akt及m-TOR有關,iAsⅢ及DMAⅢ可能通過一過性激活PI3K/Akt--

7、mTOR進而抑制此通路啟動自噬。MMAⅢ通過抑制Akt的磷酸化誘導自噬短暫發(fā)生。
　　結論:
　　由以上結果提示,三種不同的砷化合物作用于NB4細胞后,亞砷酸iAsⅢ可能通過自噬降解APL特異性融合蛋白PML/RARα,其機制可能與一過性激活PI3K/Akt-mTOR進而抑制此通路誘導自噬有關;單甲基代謝產物MMAⅢ通過抑制Akt的磷酸化誘導自噬短暫發(fā)生;二甲基代謝產物DMAⅢ一過性激活PI3K/Akt-mTOR進而抑制此通