缺氧抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)H9c2心肌細胞的表型轉(zhuǎn)變.pdf

1、纖維化的重要特征是細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）的沉積，肌成纖維細胞是ECM的主要來源。缺氧或缺氧/復(fù)氧均可導(dǎo)致心肌纖維化，引起心肌層中轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）高表達。缺氧復(fù)氧會上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子E47（Transcription Factor-3，TCF-3）的活性。TGF-β1是纖維化過程中的重要調(diào)控因子，通過上調(diào)E47，進而引起上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)

2、型（epithelial mesenchymal transition，EMT），誘導(dǎo)成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)變。目前缺氧對心肌纖維化的研究主要集中在成纖維細胞的表型去分化中，那么心肌細胞本身在缺氧的作用下，是否會上調(diào)TGF-β1，繼而通過核轉(zhuǎn)錄因子E47介導(dǎo)心肌細胞發(fā)生肌成纖維細胞化的表型轉(zhuǎn)變，從而主動參與到心肌纖維化的過程中呢？為此，我們分別觀察了缺氧、缺氧復(fù)氧和TGF-β1對心肌細胞株H9c2表型轉(zhuǎn)變的影響及其相互作用，以及利用

3、肌成纖維細胞的特異性標志物α-SMA作為評價指標，確認心肌細胞是否向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)變；以及利用TGF-β1抑制劑SB431542，判斷TGF-β1和E47的上下游關(guān)系；利用E47和p-AKT直接免疫共沉淀實驗檢測E47的磷酸化；并且觀察缺氧和TGF-β1同時作用過程中TGF-β1主要的下游信號通路Smad、MAPK和RhoA家族的表達情況。
　　方法：
　　1. TGF-β1誘導(dǎo)實驗：給予H9c2細胞不同濃度（1、5、10、

4、20、30 ng/ml）和不同時間（6、12、24、32、48 h）的TGF-β1誘導(dǎo)實驗，觀察H9c2細胞中E47和α-SMA的表達。
　　2.缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)實驗：對H9c2細胞進行不同時間的缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)實驗，缺氧1h復(fù)氧1h;缺氧1h復(fù)氧2h;缺氧2h復(fù)氧1h;缺氧2h復(fù)氧2h;缺氧3h復(fù)氧1h;缺氧3h復(fù)氧2h觀察H9c2細胞中E47和α-SMA的表達。
　　3. TGF-β1抑制劑SB431542干擾實驗：預(yù)給TGF-

5、β1抑制劑SB431542半小時后，缺氧3h復(fù)氧2h，觀察H9c2細胞中E47的表達。
　　4. E47的磷酸化檢測實驗：缺氧3h復(fù)氧2h后直接免疫共沉淀法觀察E47與p-AKT的相互作用，E47是否發(fā)生磷酸化。
　　5.缺氧誘導(dǎo)實驗：對H9c2細胞進行不同時間（1、2、3、4 h）的缺氧誘導(dǎo)實驗，觀察H9c2細胞中TGF-β1的表達。并對H9c2細胞進行不同時間（5、15、30、45、60 min，2、3、4 h）的缺氧誘

6、導(dǎo)實驗，觀察H9c2細胞中α-SMA的表達。
　　6. TGF-β1+缺氧誘導(dǎo)實驗：在H9c2細胞培養(yǎng)液中加入TGF-β1的同時進行不同時間（1、2、3、4 h）的缺氧誘導(dǎo)實驗，觀察H9c2細胞中α-SMA的表達。
　　7.信號通路的影響：觀察缺氧對TGF-β1下游信號通路Smad、MAPK和RhoA家族表達的影響。
　　結(jié)果：
　　1. TGF-β1可以劑量和時間依賴的促進E47和α-SMA的表達。5 ng/m

7、l TGF-β1作用24 h，可以誘導(dǎo)H9c2細胞中α-SMA的表達達到峰值。10 ng/ml TGF-β1作用24 h，可以誘導(dǎo)H9c2細胞中E47的表達達到峰值。
　　2.隨著缺氧復(fù)氧的時間延長，E47的表達逐漸增高，并缺氧3h復(fù)氧2h時 E47的表達達到峰值。而α-SMA的表達沒有顯著性變化。
　　3.給予TGF-β1抑制劑SB431542后，會抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的E47表達上調(diào)。
　　4.缺氧3h復(fù)氧2h，E47

8、和α-SMA并沒有明顯的結(jié)合條帶，表明E47并沒有發(fā)生磷酸化。
　　5.單純?nèi)毖跽T導(dǎo)，H9c2細胞中TGF-β1的表達在3~4 h表達增高；而α-SMA的表達沒有顯著性變化。
　　6.給予TGF-β1同時缺氧，發(fā)現(xiàn)隨著缺氧時間增加，α-SMA的表達逐漸降低至Control組水平。
　　7.給予TGF-β1同時缺氧，p-Smad2/3和p-RhoA會隨著缺氧時間延長而逐漸減低。而p-ERK先減低后增高，p-JNK和p-P