薤白EPSPs基因cDNA的克隆及功能的初步研究.pdf

1、原核生物、酵母、真菌、寄生蟲、植物和藻類中的EPSP合成酶(EPSPs)是這些生物芳香族氨基酸合成過程的關鍵酶。作為莽草酸途徑中的一個必需酶，EPSPs可逆地催化莽草酸-3-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸縮合成EPSP并產(chǎn)生無機磷。草甘膦與磷酸烯醇式丙酮酸的結構相似，可以競爭地與莽草酸羥基乙烯轉(zhuǎn)移酶結合，特異性抑制EPSPs活性，是一種廣譜滅生性除草劑。而且草甘膦在土壤中可以被降解為無毒成分，因而被認為是一種較為安全的優(yōu)良除草劑。植物中EPSP

2、s的過量表達或某些活性位點氨基酸的突變可導致其對高劑量的草甘膦的耐受性。為了提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率，從細菌中分離的耐草甘膦EPSPs基因被克隆并轉(zhuǎn)入多種農(nóng)作物中，培育出抗除草劑轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物并推廣應用獲得了很好的效果。 生產(chǎn)實踐中發(fā)現(xiàn)一種百合科蔥屬植物薤白具有較強的草甘膦抗性，其抗性來源極有可能是由于其EPSP合成酶的結構或表達獨特性，使其與草甘膦的結合能力下降而產(chǎn)生的。這種自然發(fā)生的草甘膦抗性并不多見，可為農(nóng)作物抗草甘膦的基因工程提供

3、更安全的植物來源基因資源，很有必要加以深入研究。 根據(jù)同源比較其它高等植物中EPSP合成酶基因，獲得該基因的保守序列區(qū)并設計一對簡并寡核甘酸引物。以薤白的總RNA為模板進行RT-PCR反應，克隆出了EPSPs基因0.5 Kb的中心片段，然后通過RACE技術分別獲得基因3’端包含多聚A尾的序列和5’端序列，最后獲得了薤白EPSPs cDNA全序列。薤白EPSPsA cDNA全長為1821 bp，可以翻譯成一段包含522個氨基酸的推

4、測蛋白質(zhì)。經(jīng)BLAST及蛋白質(zhì)結構推測分析，證實我們得到的cDNA序列即是薤白EPSPs基因序列，將其命名為EPSPsA，并將此序列提交GenBank，登錄號為：DQ462442。 為了進一步了解EPSPsA基因在薤白組織中的表達情況，揭示薤白芳香族氨基酸合成及其基因表達調(diào)控機制，以薤白18S rRNA為內(nèi)參基因，EPSPs基因3’非保守區(qū)域為檢測目的基因，應用RT-PCR技術對薤白EPSPs基因的表達進行半定量分析，建立一個針

5、對：EPSPs的特異、穩(wěn)定的RT-PCR半定量檢測體系。結果顯示在薤白根、莖、老葉、嫩葉中都可檢測到EPSPsA基因的表達，其表達水平為：嫩葉>根>莖>老葉，相對表達量依次為：O.631，0.246，0.218，0.120。 根據(jù)EPSPsA基因序列及原核表達載體pMAL-p2X載體多克隆位點序列，采用PCR的方法將EPSPsA基因構建到pMAL-p2X載體上獲得融合表達載體pMAL-p2X-EPSPsA，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌TB1中

6、表達，通過IPTG的誘導和SDS-PAGE的方法初步分析了表達產(chǎn)物，能誘導產(chǎn)生一條預計大小的蛋白誘導帶；將表達Ef)SPsA的細菌接種于含草甘膦的培養(yǎng)基中，檢測到細菌對草甘膦的抗性有所提高。利用大腸桿菌pREST-A表達系統(tǒng)，將除掉部分信號肽的薤白EPSPsA cDNA克隆表達，當轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)后，大腸桿菌對草甘膦的耐受性比pMAL-p2X-EPSPsA明顯提高。推測可能是薤白EPSP合酶信號肽的存在，而不能在大腸桿菌中

7、正確定位。將克隆的薤白EPSPsA cDNA正向插入到植物表達載體pWMl01中，并置于35S啟動子下游，構建成植物過表達薤白EPSPsA的重組基因。以根癌農(nóng)桿菌介導法將過表達薤白EPSPsA的重組基因轉(zhuǎn)入煙草“WS38”，先通過潮霉素抗性篩選獲得了轉(zhuǎn)基因的抗性愈傷組織，當愈傷組織培養(yǎng)3w后，將愈傷接種于含有草甘膦的培養(yǎng)基中，鑒定其草甘膦抗性。結果表明，對照煙草愈傷組織對草甘膦極為敏感，在50 mg/L濃度時，2w內(nèi)即全部壞死。而轉(zhuǎn)基因