EPSPS基因的克隆及轉化甜高粱的初步研究.pdf

1、5-烯醇丙酮酰.莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphatesynthase)基因，簡稱EPSPS基因，植物細胞主要通過EPSPS作用活性位點變化產生對除草劑草甘膦的抗性，即我們通常所說的EPSPS抗草甘膦基因。目前在美國普及的抗草甘膦大豆就是根據這個作用機理研制而成的，它的外源基因最初來自土壤桿菌(Agrobacterium sp.)CP4菌株中的EPSP合成酶基因，簡稱CP4-EPS

2、PS基因。
　　 甜高粱是目前公認的最具優(yōu)勢的糖料作物、飼料作物和能源作物。然而截止目前，在生產上，抗逆性狀優(yōu)良的甜高粱品種仍需進一步去改造。利用轉基因技術，對現有的甜高粱品種進行性狀改良及分子遺傳學基礎研究具有很大的意義，其中抗除草劑性能也是一個非常重要的方面。為了有望能夠獲得高抗逆性的新品種，建立甜高粱高效穩(wěn)定的遺傳轉化體系起到了關鍵作用，它對研制轉基因抗除草劑甜高粱新品種顯得尤為重要。
　　 本研究從抗草甘膦轉基因

3、大豆中克隆出EPSPS基因，構建好植物表達載體，然后導入農桿菌，以供下一步的遺傳轉化。并以引種至廣西南寧種植的北甜三號(BT3)的成熟種子為外植體，先建立了高效、穩(wěn)定的再生體系，再探討了農桿菌介導的遺傳轉化。目前取得的主要研究結果如下：
　　 1、從抗草甘膦大豆中克隆到EPSPS基因全長，測序驗證序列完全正確，該片段全長1368 bp，共編碼455個氨基酸。以植物表達載體PCAMBIA1300為載體，UBI和NOS分別為啟動子和

4、終止子，構建了EPSPS表達載體。
　　 2、建立了高效穩(wěn)定的甜高粱BT3組織培養(yǎng)再生體系。以成熟種子為外植體，采用95％酒精處理30-50 s，無菌水沖洗一次，再用0.2％的升汞處N23 min，無菌水沖洗3-4次可以達到理想的消毒效果。最佳誘導胚性愈傷的培養(yǎng)基為MS+2.0mg/L2，4-D+0.05 mg/L6-BA；有效的增殖培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L2，4.D+0.05 mg/L6-BA；高效的分化培養(yǎng)基為MS+1

5、.0 mg/L6-BA+0.1 mg/L NAA；生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.05 mg/L IBA和1/2MS+2.0 mg/L IBA均可。
　　 3、篩選出甜高粱胚性愈傷的潮霉素抗性臨界濃度為75 mg/L，25 mg/L的潮霉素濃度完全不能抑制住非轉基因愈傷的生長，50 mg/L潮霉素濃度培養(yǎng)基上還會產生個別數量的新愈傷，100 mg/L濃度下愈傷全部迅速死亡，而75 mg/L濃度培養(yǎng)基上還會產生1.11％的新愈傷存活率