可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體Flt-1(sFlt-1)對動脈粥樣硬化斑塊的作用.pdf

1、目的：構(gòu)建攜帶可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體Flt-1（sFlt-1）目的基因的重組真核表達(dá)載體，將sFlt-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），觀察目的基因在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，并將sFlt-1重組質(zhì)粒導(dǎo)入動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)，觀察局部高表達(dá)的sFlt-1對動脈粥樣硬化斑塊的作用。 方法：1.攜帶sFlt-1cDNA的重組基因載體的構(gòu)建：從含有目的基因的質(zhì)粒克隆模板中，利用酶切的方法獲得目的基因，酶切目的載體，純化酶切產(chǎn)物后

2、進(jìn)行定向連接，轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，對長出的克隆進(jìn)行PCR鑒定，陽性克隆證明目的基因已經(jīng)定向連入目的載體。再對PCR鑒定陽性的克隆進(jìn)行測序和分析比對，比對正確的即為構(gòu)建成功的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒載體。2.HUVEC的培養(yǎng)以及western blotting檢測sFlt-1基因在HUVEC中的表達(dá)：pEGFP-N1-sFlt-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HUVEC，通過熒光及western blotting檢測sFlt-1基因在體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的

3、表達(dá)。3.sFlt-1基因?qū)用}粥樣硬化斑塊的影響：雄性新西蘭大白兔48只，隨機(jī)分為4組。①正常對照組（n=8）。②假手術(shù)組（n=8）。③球囊損傷+高脂飲食+pEGFP-N1組（n=16）。④球囊損傷+高脂飲食+pEGFP-N1-sFlt-1組（n=16）。一、二兩組給予正常顆粒飼料飲食，三、四兩組給予高脂飲食，兩周后第二組行假手術(shù)，三、四兩組均行髂動脈球囊損傷血管內(nèi)皮，其中第三組在球囊損傷后導(dǎo)入空質(zhì)粒pEGFP-N1，第四組球囊損傷后

4、導(dǎo)入目的基因sFlt-1，3天后western blotting檢測局部sFlt-1基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)開始及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時分別檢測高脂血癥的形成情況。3個月后取靶血管行HE染色對斑塊進(jìn)行形態(tài)學(xué)測量，CD34免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)檢測觀察新生血管形成情況。 結(jié)果：1.成功構(gòu)建攜帶sFlt-1基因的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-sFlt-1，2.sFlt-1基因轉(zhuǎn)染HUVEC后有效表達(dá)，3.成功制備兔髂動脈粥樣硬化斑塊模型，4.sFlt-1基因有