結直腸癌和肝轉移血清蛋白診斷模型的優(yōu)化和相關標志物的鑒定.pdf

1、第一部分應用磁珠提取血清多肽結合MALDI-TOF MS技術建立早期診斷結直腸癌的模型
　　目的:
　　應用磁珠提取血清多肽結合基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)技術建立和驗證結直腸癌早期診斷模型并篩選出可早期診斷的蛋白標志物。
　　方法:
　　隨機選取46例結直腸癌患者和35例健康人的血清，用銅離子螯合磁珠提取血清多肽后用MALDI-TOF MS檢測肽質量指紋圖譜，并應用統(tǒng)計分析軟件根

2、據(jù)不同的運算法則建立不同模型，并用另外45個腸癌血清標本和42個健康對照人群血清標本進行檢測，從中選出有最佳診斷性能的模型。同時，另選取46個其他腫瘤患者的血清標本中進行驗證。為進一步驗證該模型的性能，另選取其他269位腸癌患者的血清和110位健康對照人群的血清對所建立的模型進行驗證。對模型中的蛋白峰進一步通過串聯(lián)質譜進行鑒定。
　　結果:
　　基于建模組和測試組的血清質譜分析，我們發(fā)現(xiàn)基于Fisher算法的擁有5個差異蛋白

3、峰（m/z1778.97、1866.16、1934.65、2022.46和4588.53）的診斷模型具有最佳的判別性能。訓練集的敏感度和特異度均為100％，測試集的敏感度和特異度分別為95.6％和83.3％。且該模型在診斷其他非腸癌腫瘤時，僅有54.3％(25/46)的準確性。進一步進行外源性驗證時，該模型可獲得94.4％(254/269)的敏感度，75.5％(83/110)的特異度和88.9％(337/379)的準確性。隨后，我們進一

4、步用串聯(lián)質譜對上述蛋白峰進行鑒定，結果判定前面4個都是補體C3f的片段。
　　結論:
　　基于Fisher算法的擁有上述5個蛋白峰的診斷模型，能有效區(qū)分腸癌患者與健康對照組和其他腫瘤，而且該模型可能具有腸癌特異性。在該模型中，在腸癌患者中濃度明顯下降的血清補體C3f，可能與腸癌的發(fā)生相關。
　　第二部分應用磁珠提取血清多肽結合MALDI-TOF MS技術建立預測結直腸癌肝轉移的模型
　　目的:
　　本研究擬

5、應用質譜技術從結直腸癌伴或不伴肝轉移患者血清中篩選蛋白標志物，建立相應的模型，從而有助于預測肝轉移的發(fā)生。
　　方法:
　　選取在復旦大學附屬中山醫(yī)院結直腸癌專業(yè)組的手術病例，根據(jù)隨訪的結果將結直腸癌患者分為3類:無復發(fā)轉移患者（根治術后至少3年以上無復發(fā)轉移）、同時性肝轉移患者（診斷腸癌時或根治術后6個月內發(fā)現(xiàn)肝轉移）和異時性肝轉移患者（根治術后6個月后發(fā)現(xiàn)肝轉移）。本研究選取其中兩類:64例異時性肝轉移患者和64例無復發(fā)

6、轉移患者，隨機抽取兩組各40個血清樣品，建立決策樹模型，并用剩余的血清樣品用來測試該模型的性能。并進一步將此模型中的蛋白峰通過串聯(lián)質譜進行鑒定。
　　結果:
　　異時性肝轉移和無復發(fā)轉移兩組患者在性別、年齡、腫瘤分布、TNM分期和組織分化程度上無顯著差別。術前血清癌胚抗原(CEA)水平不能用于預測根治術后肝轉移。本研究獲得8個蛋白峰(m/z3315、6637、1207、1466、4167、4210、2660和4186)所建立

7、的決策樹模型能夠準確區(qū)分訓練集中82.5％(33/40)的無轉移和80％(32/40)的異時性轉移，測試集中79.2％(19/24)的無轉移和70.8％(17/24)的異時性轉移。決策樹模型中使用的蛋白峰通過串聯(lián)質譜被鑒定為甲胎蛋白的片段、補體C4A的片段、纖維蛋白原α的片段、真核肽鏈釋放因子GTP結合亞基ERF3B的片段和血管緊張素原的片段等。
　　結論:
　　在本研究內性別、年齡、腫瘤分布、TNM分期和組織分化程度相匹配

8、的患者中，包括8個蛋白峰所建立的決策樹模型則可以很好地預測根治術后肝轉移的發(fā)生。
　　第三部分結直腸癌組織差異表達蛋白的鑒定和分析
　　目的:
　　腸癌是常見的惡性腫瘤，如果在早期發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)患者可通過手術治療治愈，但實際上大多患者在發(fā)現(xiàn)時已處于進展期，預后較差。因此，早期診斷腸癌是很迫切的需要。本研究通過組織蛋白質組學技術鑒定用于早期診斷腸癌的生物標志物。
　　方法:
　　收集5位病理證實為結直腸癌患者

9、的腸癌、癌旁和正常粘膜組織，應用雙向電泳技術得到雙向電泳凝膠圖譜，經(jīng)圖像分析尋找差異表達的蛋白質斑點。后將蛋白點切下經(jīng)酶切，進行質譜分析，再查庫進行蛋白質鑒定。然后，進一步用差異蛋白進行GO分析和pathway分析等生物信息學分析。此外，還應用Western Blot方法從蛋白水平驗證候選的蛋白標志物。
　　結果:
　　總計有50個蛋白質斑點在正常組與癌旁/癌組表達差異，經(jīng)過質譜鑒定，得到31個可能與腸癌發(fā)生相關的差異蛋白。

10、Gene Ontology(GO)分析顯示，按細胞組分分類，細胞質和線粒體的差異蛋白所占比例較大;按分子功能分類，涉及細胞結合、氧化還原酶活性、硫氧還蛋白過氧化物酶活性的比例較大;按生物學過程分類，氧化還原、抗凋亡、糖皮質激素刺激反應、脂肪代謝等所占比例較大。Western Blot檢測顯示I-FABP在結直腸癌組織中表達顯著下調，HSP27在結直腸癌組織中表達顯著上調。
　　結論:
　　1.運用雙向電泳結合質譜分析和生物信