豬圓環(huán)病毒2型感染誘導PK-15細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與凋亡的機制研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)是引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(porcine circovirus-associated disease，PCVAD)的主要病原。PCV2屬于圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬，其基因組是大小約為1.7 kb的單股共價閉合環(huán)狀DNA，包含三個主要的開放閱讀框（open reading frames，ORFs），分別編碼病毒復制相關(guān)蛋白（ORF1）、衣殼蛋白(ORF2)和凋亡相關(guān)

2、蛋白(ORF3)。PCV2是已知感染哺乳動物的最小的病毒。病毒主要在淋巴組織中復制，造成淋巴組織消失和組織細胞浸潤，最終導致豬的免疫抑制。免疫刺激或者與其他病原共同感染能加重疾病的發(fā)生。有關(guān)PCV2致病機理的研究已有較大進展，但仍有一些重要的機制有待闡明。
　　細胞凋亡(apoptosis)可能是PCV2感染造成淋巴組織消失的機制之一。但是凋亡究竟是病毒蛋白如ORF3或衣殼蛋白（Cap）直接導致，還是通過自噬(autophagy)

3、或未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)間接導致并不明確。UPR、自噬和凋亡在細胞長期處于應(yīng)激狀態(tài)下能通過相似的信號通路連續(xù)發(fā)生，并最終決定細胞的命運。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)在病毒的復制和成熟中起重要作用。病毒通過挾持細胞的翻譯機制在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔合成大量病毒蛋白或利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為復制場所，最終導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)。細胞通過誘導UPR來應(yīng)對應(yīng)激，或通過凋亡

4、來結(jié)束不能緩解的應(yīng)激。能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的病毒多為RNA病毒，PCV2能否誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激未有報道，我們推測PCV2誘導的凋亡可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。
　　本研究旨在探明:(1) PCV2感染能否引起UPR，以及引起UPR的關(guān)鍵病毒蛋白;(2) UPR對病毒復制的影響;(3) PCV2引起細胞UPR與凋亡之間的聯(lián)系。
　　1.PCV2感染細胞能選擇性激活UPR的PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路
　　通過免疫印跡和

5、RT-PCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志分子GRP78和UPR三條分支PERK/elF2α、ATF6和IRE1α/XBP1，我們發(fā)現(xiàn)PCV2感染PK-15細胞和豬肺泡巨噬細胞均能上調(diào)GRP78，并選擇性激活PERK通路，ATF6和IRE1α/XBP1通路均不激活。促進細胞存活的轉(zhuǎn)錄因子ATF4和促進凋亡的CHOP蛋白在PCV2感染36-48 h后上調(diào)，同時伴隨大量病毒蛋白的產(chǎn)生。因此我們推測持續(xù)的PCV2感染能夠激活PERK/elF2α/ATF4

6、/CHOP信號通路。利用表達病毒編碼蛋白的真核載體轉(zhuǎn)染細胞，免疫印跡結(jié)果表明，PCV2 Rep和Cap蛋白能誘導UPR的PERK通路。
　　2.PCV2能夠利用PERK通路和分子伴侶GRP78增強其復制
　　利用PERK通路關(guān)鍵分子的抑制劑或RNA干擾研究UPR對Cap蛋白表達和PCV2復制的影響。免疫印跡和TCID50結(jié)果表明，抑制PERK磷酸化或抑制eIF2α去磷酸化能夠顯著減少PCV2的復制(TCID50∶ GSK26

7、06414∶4.58 vs2.88，P＜0.01; siPERK∶4.53 vs2.75,P＜0.01; Salubrinal∶4.49 vs2.25, P＜0.01)，表明PCV2可能利用PERK通路幫助其復制。通過真核表達載體或藥物誘導過表達GRP78或用化學分子伴侶牛磺熊去氧膽酸處理能夠增強PCV2的復制(TCID50∶pcDNA3-GRP78∶4.03 vs5.13,P＜0.05; BIX∶4.13 vs5.12, P＜0.05

8、; thapsigargin∶2.90vs3.67，P＜0.05;TUDCA∶4.20 vs4.90，P＜0.05），而基因沉默GRP78則顯著降低Cap蛋白的表達和PCV2的復制（TCID50∶ siGRP78∶4.29 vs2.96，P＜0.05）。表明內(nèi)源性或外源性的伴侶分子可能幫助病毒蛋白正確折疊并促進病毒的復制。
　　3.PCV2通過PERK/CHOP/Bcl-2通路引起細胞凋亡
　　由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起凋亡被認為是一

9、些病毒的致病機理，如乙肝病毒感染;PCV2通過ORF3誘導凋亡尚有爭論。我們通過免疫印跡檢測凋亡關(guān)鍵分子，發(fā)現(xiàn)PCV2感染PK-15細胞后Bcl-2家族的抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL明顯下調(diào)，caspase-3發(fā)生剪切;流式細胞術(shù)和TUNEL法檢測凋亡也印證了PCV2感染能夠引起早期凋亡和DNA斷裂。通過化學分子伴侶緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能夠減少PCV2誘導的CHOP表達和caspase-3剪切，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡之間存在聯(lián)系。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)

10、激造成感受器PERK的激活以及鈣離子外流可以介導內(nèi)源性線粒體途徑的凋亡，信號通路最終匯集至線粒體，并激活凋亡執(zhí)行者caspase-3。之前已證實PCV2感染選擇性激活UPR的PERK途徑以及誘導Ca2+通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3R受體外流至細胞質(zhì)，通過化學抑制劑或RNA干擾，我們發(fā)現(xiàn)抑制PERK或IP3R能夠減輕PCV2感染誘導的凋亡。PERK下游的促凋亡分子CHOP可以通過抑制Bcl-2誘導凋亡，通過基因沉默CHOP能部分回補Bcl-2水平

11、，說明PCV2感染可能通過PERK/elF2α/CHOP/Bcl-2途徑引起凋亡。為進一步探明誘導凋亡的關(guān)鍵病毒蛋白，我們利用病毒編碼蛋白真核表達載體轉(zhuǎn)染細胞，結(jié)果表明Cap能夠通過PERK/eIF2α/CHOP通路誘導Bcl-2下調(diào)和caspase-3剪切，說明Cap蛋白在PCV2感染誘導UPR，繼而引起凋亡中起關(guān)鍵作用。
　　綜上所述，本研究闡明了PCV2感染能夠誘導UPR，并通過PERK/eIF2α/ATF4/CHOP/Bc