花生根特異啟動(dòng)子的克隆及功能分析.pdf

1、栽培花生（ArachishypogaeaL.）是我國(guó)重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，但由于地下害蟲(chóng)蠐螬的危害，花生的產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán)重影響。實(shí)驗(yàn)室前期獲得了一系列對(duì)蠐螬有殺蟲(chóng)活性的cry8類基因，如能獲得花生根部特異啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)外源殺蟲(chóng)基因在花生根部的高效表達(dá)將為蠐螬的綠色防控提供新的手段。本研究根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的基因數(shù)字表達(dá)譜，篩選、克隆花生根特異表達(dá)啟動(dòng)子，以期獲得在整個(gè)花生生長(zhǎng)季都高效表達(dá)的啟動(dòng)子，為培育抗蟲(chóng)花生新種質(zhì)提供重要的順式作

2、用元件。主要研究結(jié)果如下：
　　1．克隆了一個(gè)花生5'-甲硫腺苷/S-腺苷半胱氨酸核苷酶（5'-methylthioadenosine/S-adenosylho-mocysteine nucleosidase）基因上游1486 bp的啟動(dòng)子序列，將其初步命名為AhMtan啟動(dòng)子。對(duì)該啟動(dòng)子序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析表明，該區(qū)段含有12個(gè) ROOTMOTIFTAPOX1元件，2個(gè)OSE2ROOTNODULE元件，二者都是與根特異表達(dá)相關(guān)

3、的順式作用元件。根據(jù)根特異表達(dá)順式作用元件的分布情況，構(gòu)建了3個(gè)5'端系列缺失的植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草后，將獲得的卡那抗性苗進(jìn)行GUS染色，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)pAhMtan1247、pAhMtan523、pAhMtan235載體的煙草根部均被染成藍(lán)色，而葉片無(wú)藍(lán)色斑點(diǎn)，證明AhMtan啟動(dòng)子為根特異啟動(dòng)子，其最小核心區(qū)235 bp的啟動(dòng)子片段仍能指導(dǎo)報(bào)告基因在根部的特異表達(dá)。
　　2．克隆了一個(gè)花生赤霉素氧化酶（Gibberellin2

4、0 oxidase）基因上游2111 bp的啟動(dòng)子序列，將初步命名為AhGAox啟動(dòng)子。含有15個(gè)ROOTMOTIFTAPOX1元件，1個(gè)與OSE1ROOTNODULE元件，2個(gè) OSE2ROOTNODULE元件，三者都是與根特異表達(dá)相關(guān)的順式作用元件；構(gòu)建了3個(gè)5'端系列缺失的植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化煙草，對(duì)抗性苗進(jìn)行GUS染色，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)pAhGAox1805、pAhGAox518載體的煙草根部均被染成藍(lán)色，而葉片無(wú)藍(lán)色斑點(diǎn)，證明Ah

5、GAox啟動(dòng)子為根特異表達(dá)載體啟動(dòng)子，其最小核心區(qū)518 bp的啟動(dòng)子片段仍能指導(dǎo)報(bào)告基因在根部的特異表達(dá)。
　　3．克隆了一個(gè)花生NBS-LRR型抗逆性（NBS-LRR type disease resistance）基因上游1966bp的調(diào)控序列，將初步命名為 AhNDrp啟動(dòng)子。該區(qū)段含有10個(gè) ROOTMOTIFTAPOX1元件，2個(gè)OSE1ROOTNODULE元件和2個(gè)OSE2ROOTNODULE元件，根據(jù)基因的上游序列

6、，構(gòu)建了2個(gè)5'端系列缺失啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化煙草進(jìn)行GUS染色分析，轉(zhuǎn)pAhNDrp1360載體的煙草根部被染成藍(lán)色，而葉片無(wú)藍(lán)色斑點(diǎn)，證明AhNDrp啟動(dòng)子為根特異啟動(dòng)子。
　　4．將含有天然抗性相關(guān)的巨噬細(xì)胞蛋白基因啟動(dòng)子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草后，進(jìn)行GUS組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)1021 bp啟動(dòng)子和920 bp啟動(dòng)子載體的煙草，根部被染成藍(lán)色，而葉片無(wú)藍(lán)色斑點(diǎn)，而轉(zhuǎn)646 bp啟動(dòng)子載體的煙草，根部和葉脈處被染為藍(lán)色。證