棉花種子特異性表達啟動子的克隆及功能分析.pdf

1、隨著現代生物技術的不斷發(fā)展,種子已經不再只是農作物的繁殖器官,還作為如醫(yī)藥、化工等其他產業(yè)的生物載體。所以通過生物技術手段定向改良植物種子,已經成為現代植物基因工程上的重要課題。而種子特異性表達啟動子則是進行植物種子基因工程改良的重要工具。在目前生產試驗上采用的啟動子大多數為組成型啟動子,可啟動外源基因在受體植物中非特異性的持續(xù)、穩(wěn)定的表達,但不能從時間和空間上對外源基因的表達進行有效的調控,這可能會造成植物在能源利用上的浪費,甚至會對

2、轉基因植物造成傷害。因此種子特異性啟動子的發(fā)育時期與組織部位特異性使其顯示出顯著的優(yōu)勢。因此,研究種子特異性啟動子的調控機理具有重要的理論和現實意義。
　　 Lea(Late cmbryogenesis abundant)蛋白是胚胎發(fā)育后期在種子中大量積累的一系列蛋白質,因此,其調控序列可能提供一個很好的種子特異性表達啟動子來源。本研究從亞洲棉(Gossypiumarboreum L.)石系亞1號中克隆Lea蛋白的D113和D3

3、4基因的種子特異表達啟動子,對它們的種子特異性元件進行分析,并對其功能做進一步驗證,以期為研究種子特異性啟動子提供試驗依據和理論基礎。
　　 本研究通過PCR擴增,從石系亞1號中克隆了Lea蛋白基因家族中D113基因上游1262 bp的調控序列和D34基因上游1445 bp的調控序列。DNA序列分析結果表明,克隆到的兩個片段與已報道的Lea蛋白基因同一家族該基因的對應序列相似性分別達到97.43％和94.27％。生物信息學分析表

4、明,兩種啟動子的核苷酸序列除了含有基本啟動子元件外都還含有其它種子特異表達性表達元件,例如ABA應答元件、G-box、E-box和A／T富集區(qū)等。但這兩種啟動子的順式作用元件的數量和序列分布都不同。此外,在D113啟動子序列中還發(fā)現含有種子特異性的RY基序。進一步分析認為,啟動子元件之間的協(xié)作關系,可以增強啟動子的種子特異性。
　　 采用接頭法,成功構建了由D113啟動子和D34啟動子驅動報告基因GUS的新型植物表達載體pBI1

5、21-D113、pBI121-D34。采用農桿菌介導發(fā)轉化擬南芥,對T0代種子進行篩選,獲得部分轉基因擬南芥植株。組織化學染色發(fā)現,兩種啟動子的種子都染上藍色,而在葉、根、莖等部位都沒有染上藍色,說明兩種啟動子都是種子特異性表達的,在正常情況下不會引起功能基因在其他組織部位的特異表達。
　　 本試驗中使用的擬南芥遺傳轉化體系轉化效率較高。對卡那霉素和Agar A進行濃度梯度設置,尋找擬南芥轉基因的篩選和植株生長的最適濃度。結果表