棉花種子特異性動(dòng)子的克隆、載體構(gòu)建及△9Elo基因的轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、我國(guó)是世界產(chǎn)棉大國(guó)，精煉棉籽油產(chǎn)量高（75～85萬(wàn)噸/年），在食用油和食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛，而且棉籽油的亞油酸含量(49.5％～57.3％)明顯高于其他油料作物，能為更高不飽和脂肪酸的合成提供充足底物。利用種子特異性啟動(dòng)子，可以使外源基因在種子中特異性表達(dá)，提高表達(dá)效果。
　　本研究克隆了兩種棉花種子特異性啟動(dòng)子，分別構(gòu)建了種子特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的△9脂肪酸延長(zhǎng)酶基因(△9 fatty acid elongase gene，△9Elo)

2、和GUS基因的植物表達(dá)載體，并對(duì)擬南芥和棉花進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因植株，檢測(cè)到外源基因在擬南芥種子中特異性表達(dá)并且合成了目標(biāo)產(chǎn)物。主要研究結(jié)果如下:
　　1.以海島棉（Gossypium barbadense）新海40基因組總DNA為模板，通過(guò)touch downPCR技術(shù)，克隆了α球蛋白(α-globulin)基因啟動(dòng)子和胚胎發(fā)育后期豐富蛋白(Lateembryogenesis aboundant protein，LEA) D1

3、13基因啟動(dòng)子，分別命名為α和D，測(cè)序結(jié)果分析表明克隆片段長(zhǎng)度分別為1104bp和1232bp，與已發(fā)表序列的相似性分別為98.92％和92.93％。除了含有TATA、CAAT等啟動(dòng)子的核心元件外，還含有B-Box、G-Box、AACA基序等一些種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子的重要順式元件和基序，并且呈多拷貝形式存在，具有較高的種子特異性。
　　2.對(duì)T1代的擬南芥進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示，野生型的植株根、莖、葉、花和種子均未呈現(xiàn)藍(lán)

4、色，而轉(zhuǎn)pBI121-α和pBI121-D的植株根、莖、葉、花都無(wú)藍(lán)色出現(xiàn)，而種子均呈現(xiàn)藍(lán)色，并且轉(zhuǎn)pBI121-α的植株種子藍(lán)色較深。表明α和D兩種啟動(dòng)子均為種子特異性啟動(dòng)子，并且α啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性略高于D啟動(dòng)子的活性。
　　3.對(duì)于轉(zhuǎn)化pCamBAR-α-△9和pCamBAR-D-△9的擬南芥T2代的種子進(jìn)行脂肪酸含量的分析，結(jié)果顯示，在野生型的擬南芥種子中不含有EDA和ETrA，而在轉(zhuǎn)基因的種子中都含有EDA（含量分別為7.

5、3％和6.8％）和ETrA（含量分別為2.39％和2.34％），相應(yīng)的LA和ALA的含量有所下降，LA的含量分別由38.13％降低到32.80％和31.78％，ALA的含量由29.31％降低到21.91％和23.45％。表明兩種啟動(dòng)子都有效地啟動(dòng)了⊿9Elo基因在擬南芥種子中的表達(dá)。
　　4.以Sad1（硬脂酰-?；d體蛋白脫飽和酶）為內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，對(duì)獲得的15株棉花陽(yáng)性株進(jìn)行外源基因△9Elo拷貝數(shù)的檢測(cè)。用