體外培養(yǎng)骨髓源神經(jīng)干細胞的死亡機制及抗氧化損傷的實驗研究.pdf

1、神經(jīng)干細胞(neuralstemcells，NSCs)的研究一直是神經(jīng)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究的熱點之一，NSCs移植或促進自體腦內(nèi)NSCs再生為治療多種損傷性或退行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem，CNS)疾病提供了一鐘新的策略，已經(jīng)成為CNS疾病治療中引人注目的研究方向。NSCs基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用中，體外培養(yǎng)是最基礎(chǔ)和必不可少的階段，這一階段NSCs的生長情況以及生物學(xué)性狀的保持直接影響著體內(nèi)移植治療的效用。NSCs移植

2、已經(jīng)開始應(yīng)用于一部分病例的臨床試驗，但如何避免體外傳代培養(yǎng)及移植后NSCs的衰退和死亡，維持其長期存活、發(fā)育、分化并行使功能依然是一系列復(fù)雜而重要的問題。 相對于胚胎或成體腦內(nèi)來源NSCs及永生化神經(jīng)元，骨髓源性神經(jīng)干細胞(bonemarrowstromalcells-derivedneuralstemcells，BMSCs-d-NSCs)因其取材容易、來源充足、致瘤風險低、避免倫理爭議、可自體移植，更貼近未來臨床應(yīng)用。但因其為

3、非神經(jīng)組織來源，除一般的取材、分離，更須經(jīng)體外誘導(dǎo)、分化及調(diào)控階段，復(fù)雜的體外條件下更容易發(fā)生細胞損傷導(dǎo)致衰退和死亡。故研究BMSCs-d-NSCs衰退和死亡的機制并尋求有效手段維持和促進其長期存活具有重要臨床意義。 本研究以大鼠BMSCs-D-NsCs作為研究對象，一方面，通過分離、培養(yǎng)大鼠骨髓基質(zhì)干細胞，促其向NSCs分化，觀察其體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性，了解其不同培養(yǎng)階段的衰退和死亡(壞死和凋亡)情況；另一方面，通過抗氧化劑E

4、UK-134的抗氧化損傷作用，研究其對大鼠BMSCs-D-NSCs存活的影響，探索細胞分離培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化過程中減少其氧化損傷、促進存活的新策略。 第一部分：體外培養(yǎng)條件下骨髓源性神經(jīng)干細胞衰退和死亡情況的觀察 目的:動態(tài)觀察體外培養(yǎng)不同時間段骨髓源性神經(jīng)干細胞(bonemarrowstromalcells-derivedneuralstemcells，BMSCs-d-NSCs)的衰退和死亡情況，了解其體外培養(yǎng)條件下衰退和

5、死亡的機制與規(guī)律。 方法:以密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，以神經(jīng)干細胞專用培養(yǎng)基促其向NSCs分化，以AO染色、Rhodamine123染色、TUNEL法及.AnnexinV-EGFP/PI雙染熒光顯微鏡下直接觀察、并流式細胞儀檢測不同培養(yǎng)階段細胞凋亡和壞死情況。 結(jié)果:多種檢測方法證實，BMSCs-d-NSCs在體外培養(yǎng)條件下7d、14d、21d、4w、8w均會出現(xiàn)不同程度以凋亡為主的衰退和死亡現(xiàn)象，培養(yǎng)4w以

6、上細胞凋亡和壞死情況較3w內(nèi)明顯增多。 結(jié)論:體外培養(yǎng)BMSCs-d-NSCs的衰退和死亡有凋亡和壞死兩種機制的共同參與，并隨時間延長凋亡和壞死事件逐漸增多，為下一步探索相應(yīng)的細胞保護研究奠定了實驗基礎(chǔ)。 第二部分：EUK-134對骨髓源性神經(jīng)干細胞抗氧化損傷作用的實驗研究 目的:研究抗氧化劑EUK-134對體外培養(yǎng)條件下骨髓源性神經(jīng)干細胞(bonemarrowstromalcells-derivedneural

7、stemcells，BMSCs-d-NSCs)的抗氧化損傷作用。 方法:以密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，以神經(jīng)干細胞專用培養(yǎng)基促其向NSCs分化，以0.5mM、1mM、2mM三種濃度EUK-134添加培養(yǎng)基培養(yǎng)BMSCs-d-NSCs，分別在2w、4w時以AnnexinV-EGFP/PI雙染流式細胞儀檢測，以同一取材的未添加EUK-134常規(guī)培養(yǎng)的同期細胞為對照，比較各組細胞凋亡和壞死情況。 結(jié)果:各組細胞傳代培

8、養(yǎng)后，各EUK-134處理組較對照組活力更為旺盛，增殖速度快，細胞凋亡和壞死情況減少。經(jīng)流式細胞儀檢測，結(jié)果可見培養(yǎng)2w時各組間凋亡細胞和壞死細胞比例均有明顯差異；1mM、2mMEUK-134處理組細胞凋亡和壞死比例均明顯少于對照組。培養(yǎng)4w時各組凋亡細胞和壞死細胞比例也均有明顯差異；各EUK-134處理組細胞凋亡和壞死比例均明顯少于對照組，且1mM、2mM處理組細胞凋亡和壞死比例也少于0.5mM處理組。 結(jié)論:抗氧化劑EUK-

9、134可以減少體外培養(yǎng)BMSCs-d-NSCs的凋亡和壞死，特別是以1.0mM、2.0mMEUK-134培養(yǎng)細胞，更具明顯的抗氧化損傷作用，能夠增強細胞活力，減少細胞的凋亡和壞死事件的發(fā)生。 本課題致力于研究體外培養(yǎng)骨髓源性神經(jīng)干細胞衰退和死亡的機制并尋求維持和促進其長期存活的有效手段。 本實驗以體外培養(yǎng)BMSCs-d-NSCs為研究對象，選用四種方法聯(lián)合檢測，分別從細胞形態(tài)學(xué)、線粒體跨膜電位、生化改變、細胞膜水平、細胞

10、核DNA片斷化等不同角度，以及應(yīng)用相差顯微鏡、熒光顯微鏡、流式細胞儀等多種手段動態(tài)觀察、驗證和區(qū)分BMSCs-d-NSCs體外培養(yǎng)過程中衰退死亡情況。 結(jié)果證實： (一)BMSCs-d-NSCs在體外培養(yǎng)不同階段的細胞死亡事件中，均有凋亡和壞死兩種機制的共同參與，并多以凋亡為主，隨時間延長細胞凋亡和壞死情況均逐漸增多，培養(yǎng)4w后較3w內(nèi)更為明顯。 (二)抗氧化劑EUK-134可以明顯減少體外培養(yǎng)BMSCs-d-N