肛門直腸畸形大鼠盆底肌異常發(fā)育機(jī)制及成肌細(xì)胞移植治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前言：先天性肛門直腸畸形(Anorectal Malformations,ARMs)是最常見的小兒消化道畸形,是世界衛(wèi)生組織常規(guī)監(jiān)測(cè)的先天畸形之一,占消化道畸形的1/4,發(fā)病率為1/5000～1/1500。盡管長(zhǎng)期以來對(duì)肛門直腸畸形的手術(shù)方式的不斷改進(jìn)及術(shù)后監(jiān)護(hù)水平的不斷提高,其總體預(yù)后得到了明顯改善。但長(zhǎng)期隨訪發(fā)現(xiàn),仍有許多中高位肛門直腸畸形患兒術(shù)后存在不同程度的排便功能障礙,嚴(yán)重影響患兒的生理及心理健康。術(shù)后肛門直腸功能不良取決于許

2、多因素,諸如盆底神經(jīng)肌肉發(fā)育異常、腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙、骶尾椎畸形等等。而盆底肌作為控制排便功能的關(guān)鍵元素,其發(fā)育程度無疑是決定術(shù)后排便功能最重要的因素之一。
　　 大量臨床研究及前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已發(fā)現(xiàn),中高位肛門直腸畸形伴有不同程度的盆底肌發(fā)育異常,是導(dǎo)致術(shù)后排便功能障礙的主要原因。但迄今為止,肛門直腸畸形盆底肌胚胎異常發(fā)育機(jī)制尚不清楚,也缺乏有效地、有針對(duì)性的治療方法。
　　 凋亡在胚胎發(fā)育及維持組織穩(wěn)定等各種生理過程中

3、起關(guān)鍵作用,也參與多種病理過程。在骨骼肌的不同發(fā)育階段,如原始肌團(tuán)分離形成各組肌肉、神經(jīng)肌肉接頭形成、不同類型肌纖維比例改變及肌肉塑形重建過程中均有凋亡的參與。研究發(fā)現(xiàn),在肛門直腸畸形胚胎尾腸退化、尿直腸隔與泄殖腔膜融合及肛膜破裂時(shí)均存在異常凋亡現(xiàn)象。在正常盆底肌胚胎發(fā)育過程中是否有凋亡的參與,凋亡在肛門直腸畸形盆底肌異常發(fā)育過程中是否也起作用目前尚不得而知。
　　 隨著分子生物學(xué)的研究進(jìn)展以及細(xì)胞示蹤技術(shù)的應(yīng)用,已初步闡明骨骼

4、肌胚胎發(fā)育的發(fā)生機(jī)制。脊椎動(dòng)物的骨骼肌起源于體節(jié),體節(jié)來源的生肌祖細(xì)胞在周圍信號(hào)因子的作用下啟動(dòng)生肌程序。而位于肢體水平的體節(jié),其生皮肌節(jié)側(cè)緣去上皮化,生肌祖細(xì)胞分離形成單個(gè)細(xì)胞,在各種趨化因子的引導(dǎo)下,向遠(yuǎn)處移行。到達(dá)靶定部位后,在局部信號(hào)作用下,激活肌特異性基因,表達(dá)生肌調(diào)節(jié)因子,啟動(dòng)肌細(xì)胞分化增殖,形成骨骼肌原始肌纖維。在胚胎發(fā)育晚期,基底膜形成以后,部分生肌祖細(xì)胞定植于基底膜與肌纖維膜之間轉(zhuǎn)化形成衛(wèi)星細(xì)胞,保持不分裂、靜止?fàn)顟B(tài)。

5、骨骼肌的發(fā)育成熟是在原始肌纖維基礎(chǔ)上,通過衛(wèi)星細(xì)胞活化增殖并啟動(dòng)成肌過程,同原有的骨骼肌細(xì)胞相互融合,或是彼此融合,形成新的骨骼肌纖維。作為骨骼肌的專性干細(xì)胞,衛(wèi)星細(xì)胞在正常盆底肌的胚胎動(dòng)態(tài)發(fā)育過程如何;在肛門直腸畸形盆底肌異常發(fā)育時(shí)是否也存在衛(wèi)星細(xì)胞發(fā)育缺陷;干細(xì)胞賴以生存并為其提供各種支持的微環(huán)境發(fā)育情況,目前在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中均未見報(bào)道。
　　 當(dāng)前對(duì)排便功能障礙的治療主要局限于功能刺激生物反饋及周圍肌肉轉(zhuǎn)移替代治療方面,通過

6、改變肛管直腸角或建立神經(jīng)反射弧等來促進(jìn)排便控制,沒有從根本上解決盆底肌發(fā)育不良問題。雖然取得了一定的近期療效,但長(zhǎng)期隨訪發(fā)現(xiàn)并不能達(dá)到滿意的控制排便功能。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞作為骨骼肌專性干細(xì)胞,具有在體內(nèi)或體外分化成肌的能力,已經(jīng)越來越多地被應(yīng)用于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床研究,在缺血心肌再生、膈肌重建及膀胱括約肌重建等方面取得了成功。應(yīng)用衛(wèi)星細(xì)胞移植治療盆底肌發(fā)育不良有望成為改善肛門直腸畸形術(shù)后排便功能極具前景的治療策略。
　　 本文應(yīng)用乙烯

7、硫脲(ethylenethiourea,ETU)致畸建立的Wistar大鼠ARMs動(dòng)物模型,研究正常胎鼠及肛門直腸畸形胎鼠盆底肌胚胎發(fā)育過程中的細(xì)胞凋亡,以及Bcl-2/Bax時(shí)空表達(dá)差異;同時(shí)研究正常胎鼠及肛門直腸畸形胎鼠盆底肌衛(wèi)星細(xì)胞及其微環(huán)境的胚胎動(dòng)態(tài)發(fā)育,分別從細(xì)胞凋亡及干細(xì)胞水平探索肛門直腸畸形盆底肌異常發(fā)育潛在機(jī)制。另外通過提取骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞經(jīng)過體外培養(yǎng)增殖,綠色熒光蛋白標(biāo)記后種植入經(jīng)物理化學(xué)方法建立的橫紋肌復(fù)合體去細(xì)胞支架

8、內(nèi),移植入盆底后觀察在體內(nèi)分化形成骨骼肌情況,探索衛(wèi)星細(xì)胞移植治療肛門直腸畸形盆底肌發(fā)育不良的可行性。
　　 實(shí)驗(yàn)材料：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 體重250～300克的Wistar大白鼠,體重80-100克Wistar公鼠由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
　　 2.實(shí)驗(yàn)試劑
　　 ①乙烯硫脲Ethylenethiourea,ETU(購自德國(guó)Sigma-Aldrich公司)；
　

9、　 ②TUNEL試劑盒(購自德國(guó)Roche公司)；
　　 ③Bcl-2/Bax抗體、Myogenin抗體及SYP抗體(購自美國(guó)Santa Cruz公司),Vimentin抗體、Neurofilament抗體、vWF抗體、Desmin抗體及Myosin抗體(購自美國(guó)Lab Vision公司),Laminin抗體(購自英國(guó)Abcam公司),MyoD抗體(購自美國(guó)BD公司),Pax7抗體(購自美國(guó)R&D公司),GFP抗體(購自美國(guó)C

10、hemicon公司)；
　　 ④山羊抗小鼠IgG-TRITC(購自美國(guó)Chemicon公司),山羊抗兔IgG-Alexa Fluor488(購自美國(guó)Invitrogen公司),免疫組化超敏試劑盒(購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司),二步法山羊免疫組化檢測(cè)試劑盒(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；
　　 ⑤eGFP腺病毒(購自北京諾賽基因組研究中心有限公司)；
　　 ⑥bFGF(購自英國(guó)Pepro公司),鼠尾膠原

11、(購自杭州生友生物技術(shù)有限公司),Ⅰ型膠原酶(購自德國(guó)Sigma-Aldrich公司),胰酶(購自美國(guó)HyClone公司),胎牛血清(購自美國(guó)GIBCO公司),Ham's F10培養(yǎng)基(購自美國(guó)GIBCO公司)；
　　 ⑦逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自大連寶生物工程有限公司)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1.動(dòng)物模型制備及病理切片Wistar孕鼠于妊娠第10天(E10),按125mg/kg經(jīng)胃管給予1％ETU,制作ARMs大鼠

12、動(dòng)物模型,對(duì)照組給予等量的生理鹽水。妊娠第16-21天剖宮取胎,尾部軀干經(jīng)4％多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋,進(jìn)行矢狀面、橫斷面或冠狀面連續(xù)切片。
　　 2.盆底肌胚胎發(fā)育過程中的細(xì)胞凋亡研究應(yīng)用TUNEL染色、DNA ladder方法研究正常胎鼠及肛門直腸畸形胎鼠盆底肌發(fā)育過程中的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。同時(shí)通過Bcl-2/Bax的免疫組織化學(xué)染色及RT-PCR方法,研究Bcl-2/Bax在盆底肌胚胎發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá),

13、探索其對(duì)盆底肌凋亡的可能調(diào)控作用。
　　 3.盆底肌衛(wèi)星細(xì)胞及其微環(huán)境的胚胎發(fā)育研究應(yīng)用免疫熒光化學(xué)染色及real-time PCR技術(shù),研究正常胎鼠及肛門直腸畸形胎鼠盆底肌衛(wèi)星細(xì)胞胚胎動(dòng)態(tài)發(fā)育,并且對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)分析、衛(wèi)星細(xì)胞分離培養(yǎng)及分化能力的鑒定。通過對(duì)vWF、Neurofilament、Vimentin蛋白進(jìn)行免疫熒光化學(xué)染色,研究衛(wèi)星細(xì)胞微環(huán)境的胚胎發(fā)育,從干細(xì)胞水平探索盆底肌異常發(fā)育的可能發(fā)生機(jī)制。
　

14、　 4.成肌細(xì)胞移植重建盆底橫紋肌復(fù)合體提取肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)分化形成成肌細(xì)胞,應(yīng)用免疫熒光染色及流式細(xì)胞技術(shù)鑒定,經(jīng)攜帶eGFP的腺病毒轉(zhuǎn)染后,移植入經(jīng)過物理化學(xué)方法處理建立的橫紋肌復(fù)合體去細(xì)胞支架中,帶細(xì)胞支架移植回體內(nèi)4周后檢測(cè)其在體內(nèi)分化形成骨骼肌情況,初步探索成肌細(xì)胞移植治療盆底肌發(fā)育不良的可行性。
　　 5.結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)均以(x-)±s表示,差異比較采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行各胎齡正常組與ARMs

15、組的t檢驗(yàn)或單因素方差分析,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.肛門直腸畸形盆底肌發(fā)育過程中的細(xì)胞凋亡模式改變正常胎鼠16天時(shí),盆底橫紋肌復(fù)合體未見明顯的TUNEL陽性凋亡細(xì)胞,孕17天以后出現(xiàn)的零星陽性細(xì)胞主要集中在橫紋肌復(fù)合體與球海綿體肌交界區(qū)及直腸后兩側(cè)橫紋肌復(fù)合體匯合處。肛門直腸畸形胎鼠,TUNEL陽性細(xì)胞在孕16天時(shí)就非常明顯,大量的陽性細(xì)胞主要分布在橫紋肌復(fù)合體的背側(cè)。兩組間各孕齡組凋

16、亡指數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DNA ladder結(jié)果顯示畸形組條帶更加明顯。
　　 2.Bcl-2/Bax的時(shí)空表達(dá)差異免疫組織化學(xué)染色及RT-PCR結(jié)果表明,E16時(shí)未見明顯的Bcl-2/Bax的表達(dá),E17后Bcl-2/Bax的表達(dá)逐漸增強(qiáng)。與正常組比較,肛門直腸畸形大鼠盆底肌存在Bcl-2/Bax的時(shí)空表達(dá)異常,Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào),分別為0.44±0.06 vs.0.49±0.07(17天),0.69±0.09 vs.0

17、.90±0.14(19天),0.51±0.07 vs.0.71±0.11(21天),孕19及21天時(shí)有顯著性差異。而Bax基因表達(dá)上調(diào),分別為0.39±0.04 vs.0.31±0.03(17天),0.47±0.05 vs.0.37±0.04(19天),0.40±0.05 vs.0.37±0.05(21天),孕17及19天時(shí)差異有顯著性意義。
　　 3.盆底肌衛(wèi)星細(xì)胞胚胎動(dòng)態(tài)發(fā)育過程異常對(duì)Myogenin及Pax7的定性及定量研

18、究發(fā)現(xiàn),正常胎鼠16天時(shí)盆底肌已有Myogenin陽性表達(dá),隨著胎齡增加,Myogenin表達(dá)逐漸增強(qiáng);孕17天以后出現(xiàn)Pax7陽性的衛(wèi)星細(xì)胞,孕19天陽性率最高,孕21天時(shí)有時(shí)下降。而肛門直腸畸形胎鼠盆底肌Myogenin表達(dá)明顯減弱,胚胎晚期差異愈發(fā)明顯;孕16天時(shí)即有較強(qiáng)的Pax7陽性表達(dá),孕17天后表達(dá)增強(qiáng),與正常組比較,Pax7陽性細(xì)胞比例明顯增加。
　　 4.衛(wèi)星細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化透射電鏡掃描提示正常組盆底肌肌纖維排列

19、規(guī)則,肌橫紋明顯;衛(wèi)星細(xì)胞位于基底膜與肌漿膜之間,細(xì)胞規(guī)則,核漿比例較高,胞核呈橢圓形;胞膜與肌漿膜緊密接觸,被薄薄的基底膜共同包繞。肛門直腸畸形盆底肌肌纖維排列紊亂,肌橫紋不明顯;衛(wèi)星細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則、異染色質(zhì)增多;衛(wèi)星細(xì)胞與肌細(xì)胞間的細(xì)胞間隙增大,基底膜明顯增厚。
　　 5.肛門直腸畸形盆底肌衛(wèi)星細(xì)胞分化障礙從胎鼠盆底肌提取的衛(wèi)星細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后進(jìn)行細(xì)胞分化能力鑒定,培養(yǎng)24小時(shí)后,兩組細(xì)胞均表現(xiàn)出MyoD/Myogen

20、in陽性表達(dá);培養(yǎng)72小時(shí)后,正常組細(xì)胞MyoD表達(dá)明顯下降(11.83％),而畸形組細(xì)胞仍有較高比例的MyoD表達(dá)(35.28％);培養(yǎng)120h后正常組細(xì)胞每個(gè)視野下可見到平均10個(gè)Myosin陽性的多核肌管形成,而畸形組Myosin陽性細(xì)胞明顯減少,兩組間具有顯著差異。
　　 6.肛門直腸畸形時(shí)盆底肌衛(wèi)星細(xì)胞微環(huán)境發(fā)育缺陷免疫熒光化學(xué)染色顯示在正常組中,vWF表達(dá)明顯,在SMC橫斷面上呈均勻分布,可見較多Neurofilam

21、ent陽性表達(dá)的神經(jīng)纖維,肌束之間可見少量Vimentin陽性表達(dá)。而在ARMs組,vWF表達(dá)較弱,多分布在橫紋肌復(fù)合體的周邊,Neurofilament的表達(dá)極其微弱,幾乎在每根肌束周圍都可見Vimentin陽性表達(dá)的纖維組織。
　　 7.分離培養(yǎng)的衛(wèi)星細(xì)胞存在兩個(gè)不同的亞群貼壁較早的細(xì)胞增殖速度較快,傳代能力有限,很快分化融合成多核肌管;而晚貼壁細(xì)胞中有較多呈球形或短梭形的細(xì)胞,該群細(xì)胞有較高的核漿比例,表達(dá)衛(wèi)星細(xì)胞特異性標(biāo)

22、記Pax7,保持干細(xì)胞或類似干細(xì)胞狀態(tài),其增殖速度慢,傳代次數(shù)相對(duì)較多。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),晚貼壁細(xì)胞中仍有較高比例的短梭形細(xì)胞存在。
　　 8.提取培養(yǎng)的衛(wèi)星細(xì)胞在體外具有分化成肌能力衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)后能分化形成Desmin染色陽性的成肌細(xì)胞,并融合形成Myosin陽性的多核肌管,分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周后在倒裝顯微鏡下可以見到肌纖維的自主收縮。
　　 9.移植的成肌細(xì)胞在體內(nèi)分化形成肌纖維攜帶成肌細(xì)胞的橫紋肌復(fù)合體支架移植

23、入體內(nèi)后分化形成肌團(tuán),免疫熒光染色提示Myosin及GFP雙重表達(dá)陽性,在肌纖維周圍可見vWF陽性染色的血管內(nèi)皮細(xì)胞,肌纖維膜下可見Pax7陽性染色細(xì)胞,占據(jù)衛(wèi)星細(xì)胞位置。
　　 結(jié)論：
　　 1.凋亡在正常橫紋肌復(fù)合體胚胎發(fā)育過程中起重要作用;異常凋亡可能是肛門直腸畸形時(shí)橫紋肌復(fù)合體發(fā)育不良的基本病理過程;Bcl-2/Bax的時(shí)空表達(dá)仍然是調(diào)節(jié)橫紋肌復(fù)合體凋亡的重要因子。
　　 2.過早形成了衛(wèi)星細(xì)胞使得形成肌