高濃度葡萄糖促進人內皮細胞活性氧升高的機制探討.pdf

1、血糖升高是糖尿病的主要特點之一。動脈粥樣硬化是糖尿病的嚴重并發(fā)癥，氧化應激在此過程中起重要作用。氧化應激是指體內活性氧（ROS）產生過多超過了機體自身的清除能力從而在體內蓄積導致機體損傷。機體內產生ROS主要有以下五種途徑：黃嘌呤氧化酶、NADPH氧化酶（NOX）、線粒體電子傳遞鏈、一氧化氮合酶及脂氧合酶，其中NOX可能是血管內皮細胞中ROS的主要來源。吞噬型NADPH氧化酶是由多個亞基組成的酶復合體，主要包括胞膜組分：細胞色素b558

2、（gp91phox和p22phox）和胞漿組分：p47phox、p67phox及Rac（小的GTP結合蛋白）共五個亞組分。Gp91phox（有NADPH、heme、FAD的潛在結合位點）和p22phox是NOX的酶促核心，它們受p47phox及Rac的調節(jié)。近幾年在對各種組織的研究中發(fā)現(xiàn)NOX有5種同源家族體，分別稱為NOX1、NOX2（gp91phox）、NOX3、NOX4和NOX5，血管內皮細胞主要表達其中的NOX2和NOX4，且N

3、OX4表達水平比NOX2高約20倍。進一步的研究顯示，血管內皮細胞產生的ROS主要來源于NOX4。研究表明，高濃度葡萄糖能夠通過上調人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）中NOX4的表達，引起ROS升高，而NOX抑制劑能夠抑制葡萄糖的這種作用。在此基礎上，進一步對NOX的信號調節(jié)機制進行了探討。 目的:探討高糖處理HUVECs時ROS水平的改變及其主要生成途徑，觀察NOX亞組分表達的變化并研究NOX的調節(jié)機制。 方法:用Ⅱ型膠

4、原酶消化分離培養(yǎng)HUVECs，在倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)。免疫熒光法檢測HUVECs內第Ⅷ因子相關抗原的表達；RT-PCR、Real-time PCR和western blot分析NOX及其亞單位表達的變化；流式細胞儀檢測細胞內ROS的水平；免疫熒光法觀察NOX亞組分p47phox的細胞內定位。 結果:分離得到的HUVECs均表達第Ⅷ因子相關抗原；高糖處理HUVECs后細胞內ROS升高、NOX4表達明顯上調；NOX抑制劑DPI能夠

5、抑制NOX4表達的上調和細胞內ROS的升高；在ROS產生過程中p47phox向核膜移位，Apocynin(p47phox抑制劑)能夠抑制p47phox的核膜移位、ROS的升高及NOX4的上調；PMA(PKC激動劑)通過促進p47phox向核膜移位誘導ROS的產生，Hyperinin(PKC抑制劑)能抑制這種作用。 結論:高糖處理HUVECs時細胞內ROS升高主要來源于NADPH氧化酶；高糖上調HUVECs內NOX4表達；高糖通過