脂肪源間充質干細胞復合異種骨支架構建組織工程骨.pdf

1、背景： 臨床上器官與組織的缺損是困擾眾多臨床醫(yī)生和患者的疾病，傳統(tǒng)方法多采用自體或異體器官組織移植來重建與修復。由于受到供體來源限制以及免疫排斥、傳播疾病等危險因素影響，人們很早就開始尋找植入性替代物來滿足臨床需要。組織工程學是近二十年左右迅猛發(fā)展的新學科，將對組織器官的修復與替代治療產生劃時代意義。組織工程的出現(xiàn)，為骨科醫(yī)生和骨缺損患者帶來了新的希望。組織工程技術大致由四大要素組成：種子細胞的獲得；種子細胞的生長與分化；復合有

2、細胞的載體移入體內；移植物與受區(qū)整合，組織形成。種子細胞和支架材料是骨組織工程所必需的兩個最基本的要素，尋找適宜的新型支架材料已成為骨組織工程研究的熱點。 目前對天然骨進行處理制成支架材料的研制尚在起步階段，而國外已有產品問世，并在臨床應用中取得很好效果。同種異體骨雖然力學性能和生物相容性好，但材料的來源少，且存在法律和倫理方面等的種種問題。異種骨來源廣泛，價格低廉，經過適當處理即能使其保留骨誘導作用，并提供骨支架使其具有骨傳導

3、作用。 在骨組織工程中，成骨細胞的獲取與培養(yǎng)是基礎和重要的環(huán)節(jié)。脂肪中含有豐富的間充質細胞，其中包括脂肪源間充質干細胞。來源于人脂肪組織的脂肪源間充質干細胞具有向成脂肪、成軟骨、成骨、成肌細胞和神經源細胞分化的多分化潛能，是一種理想的種子細胞。 目的： 為構建組織工程化骨，制備豬源性異種骨支架材料，并與同種異體骨支架材料對比檢測豬源性異種骨支架材料的理化性能和毒性，驗證脂肪源間充質干細胞作為骨組織工程的種子細胞的

4、可行性，并初步嘗試以脂肪源間充質干細胞作為種子細胞，與豬源性異種骨支架材料體外復合培養(yǎng)構建組織工程化骨。 材料與方法： 取低溫深凍6個月的豬髂骨和新鮮健康成人尸體髂骨，制成5mm×5mm× 40mm左右的骨條，超聲清洗、10％H<,2>O<,2>浸泡、75％酒精浸泡、抽真空凍干后輻照滅菌備用。掃描電鏡觀察支架材料的網狀孔隙結構系統(tǒng)、三維孔狀結構及材料孔徑，測定材料孔隙率、蛋白質含量、鈣磷含量及彈性模量。 制作異種

5、骨支架材料和人同種異體骨支架材料的浸提液培養(yǎng)脂肪源間充質干細胞，倒置顯微鏡觀察細胞，評價細胞一般形態(tài)、空泡形成、脫落、細胞溶解和膜的變化，流式細胞儀PI法檢測細胞生命周期。皮下植入2種材料，在植入4W、8W、12W、16W取材做石蠟切片HE染色觀察和掃描電鏡觀察。采用差速貼壁培養(yǎng)法分離脂肪源間充質干細胞，并與普通培養(yǎng)法得到的脂肪源間充質干細胞進行CD44陽性鑒定和用流式細胞儀檢測細胞的CD44陽性率。在第2代脂肪源間充質干細胞中加入條件

6、培養(yǎng)基進行誘導，根據(jù)條件培養(yǎng)基的不同分成3組：①成骨誘導組：加入成骨培養(yǎng)基；②成脂誘導組：加入成脂培養(yǎng)基；③對照組：僅加入基礎培養(yǎng)基。成骨誘導組和對照組進行堿性磷酸酶檢測，成脂誘導組和對照組進行油紅O染色檢測。 將第2代脂肪源間充質干細胞與異種骨支架材料和人同種異體骨支架材料進行復合培養(yǎng)，在第7d取材料做處理后掃描電鏡觀察。連續(xù)7天用MTT法測定復合培養(yǎng)后細胞活性并繪制細胞增殖曲線。在第4d、8d、12d測定細胞堿性磷酸酶活性。

7、 結果： 2種材料均具有骨本身的骨小梁、小梁間隙及骨內管腔系統(tǒng)，具有天然網狀結構。三維支架系統(tǒng)形態(tài)完整。其中豬源性異種骨支架材料較人同種異體骨支架材料具有更多的三維孔隙，2種材料的孔隙大小接近，均在400μm左右。異種骨支架材料的孔隙率(57.20±1.37％)高于同種異體骨(53.21±1.63)，但蛋白含量(23.36±0.48％)低于同種異體骨(26.50±0.23)，鈣(1.7×10<'5>μg/g)磷(1.0×

8、10<'5>μg/g)含量與同種異體骨鈣(1.8×10<'25>μg/g)磷(1.0×10<'5>μg/g)含量無顯著性差異，異種骨支架材料和同種異體骨支架材料的彈性模量分別為 1089.89±915.65MPa和550.34±435.80MPa，無顯著差異。豬源性異種骨支架材料浸提液組細胞呈梭型，有粗大的突起，并以突起互相連接，細胞核大，圓形，核漿比例大。豬源性異種骨支架材料浸提液組、同種異體骨支架材料浸提液組以及空白對照組的細胞均生

9、長狀態(tài)良好，增殖旺盛，形態(tài)沒有明顯差別。流式細胞儀PI法檢測細胞生命周期見3組細胞G<,1>期、G<,2>期細胞百分率接近。皮下植入實驗動物狀態(tài)良好。 術后4W，2種植入材料周圍有明顯的結締組織包裹，組織學切片觀察，發(fā)現(xiàn)有結締組織增生，其間有炎性細胞浸潤，有成骨細胞在材料周圍規(guī)則排列，有異位成骨趨勢，材料周圍已有類骨質和軟骨樣結構出現(xiàn)。術后8W，材料周圍組織基本無炎癥反應，材料開始有部分降解。術后12W，材料周圍組織無炎癥反應，

10、材料降解較多，異位成骨的趨勢更為明顯。術后16W，材料周圍無組織炎癥反應，無炎癥細胞浸潤，大部分材料降解，且豬源性異種骨支架材料降解較同種異體骨支架材料降解更為迅速，見到的剩余材料少。電鏡觀察見術后4W，2種植入材料周圍有明顯的結締組織包裹，有結締組織增生，材料表面較為光滑，材料與包裹的結締組織間界限明顯。術后8W材料表面粗糙，開始有部分降解，材料與包裹在其周圍的結締組織間界限不清，有少量結締組織伸入材料內部。術后12W材料表面更加粗糙

11、，降解較多，從包裹在材料周圍的結締組織中有大量組織長入材料，材料不完整，見到大量骨片。術后16W材料表面粗糙程度較12W時為甚，基本見不到完整的骨組織，從包裹在材料周圍的結締組織被膜中向材料延伸出大量組織，且豬源性異種骨支架材料降解較同種異體骨支架材料降解更為迅速。 普通培養(yǎng)的細胞在培養(yǎng)后2h即有少量細胞貼壁，差速貼壁與普通培養(yǎng)的細胞在培養(yǎng)48h后完全貼壁，呈多邊形，立體感較強，細胞增殖迅速，4d左右趨于單層匯合，細胞界限不清，

12、絕大部分呈梭形或多角形，有時突起較多。差速貼壁與普通培養(yǎng)的細胞在傳代后，細胞24h內完全貼壁，3d達到大部分融合，細胞呈梭形或多角形，突起較原代明顯減少，傳至7代后，細胞仍然保持良好的增殖能力，細胞形態(tài)很均勻，形態(tài)無明顯變化。差速貼壁和普通培養(yǎng)脂肪源間充質干細胞的CD44陽性鑒定顯示有大量呈CD44陽性的脂肪源間充質干細胞存在。流式細胞儀檢測差速貼壁與普通培養(yǎng)脂肪源間充質干細胞的CD44陽性率分別為86.12±1.55％和74.03±1

13、.06％，具有顯著差異性。第2代脂肪源間充質干細胞不表達或較低表達ALP，經成骨誘導7d后ALP染色即有陽性細胞的胞漿被染成灰黑色，隨誘導時間延長而陽性細胞增多。油紅。染色證實脂肪源間充質干細胞在脂肪誘導下胞漿內出現(xiàn)脂滴，且細胞內脂滴隨培養(yǎng)時間延長逐漸增加。 脂肪源間充質干細胞在支架材料中的增殖復合培養(yǎng)后，細胞增殖數(shù)均呈現(xiàn)隨培養(yǎng)時間延長而增長的趨勢。掃描電鏡觀察到在2種材料上均可見到脂肪源間充質干細胞存活并與材料貼附，細胞呈梭形

14、或者多角形，伸出較多觸絲與材料結合。細胞數(shù)目隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增加。豬源性異種骨支架材料和人同種異體骨支架材料的脂肪源間充質干細胞內堿性磷酸酶的半定量值變化趨勢基本與脂肪源間充質干細胞增殖情況一致，均呈現(xiàn)隨培養(yǎng)時間延長，而ALP相對活性有增高的趨勢。 結論： 脂肪源間充質干細胞是一種優(yōu)良的骨組織工程種子細胞，而豬源性異種骨支架材料在理化性能和材料毒性等方面與同種異體骨支架材料接近，完全能夠取代人同種異體骨支架材料用