TGF-β1誘導的Fascin1基因表達對胃癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移影響的研究.pdf

1、前言：胃癌是一種常見的惡性腫瘤，據(jù)有關文獻報道，在我國其死亡率居各種惡性腫瘤之首。胃癌患者的主要死因為腫瘤病灶的侵襲及轉(zhuǎn)移。因此探討其侵襲轉(zhuǎn)移機制顯得尤為重要。 在眾多的促轉(zhuǎn)移分子中，轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta，TGFβ)是一重要分子，它參與了多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。用基因轉(zhuǎn)染的方法誘導腫瘤細胞中TGF-β1表達可增加腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力。同時有研究表明，阻止TGF-β信號通路

2、可以抑制胃癌的轉(zhuǎn)移。我們的早期研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可以促進胃癌細胞SGC7901和BGC823的浸潤和轉(zhuǎn)移。一些臨床研究也顯示：TGF-β1的表達與淋巴結的轉(zhuǎn)移和預后不良呈正相關。目前雖然已有許多研究證實了TGF-β1在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用，但其具體機制尚不明確。 研究表明TGF-β促浸潤轉(zhuǎn)移作用可由smad依賴通路及smad非依賴通路介導。TGF-β與細胞膜II型受體(Tβ RII)結合后，激活I型受體，活化的I型受體激活下

3、游分子smad2和smad3，隨后smad2/smad3與smad4結合形成smad復合物并轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，調(diào)節(jié)TGF-β介導的靶基因轉(zhuǎn)錄。而在smad非依賴通路中，JNK，Erk和P38通路則被認為是關鍵性的通路。基于TGF-β在腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移中的重要性，所以深入探討TGF-β促轉(zhuǎn)移機制具有非常重要的理論及臨床意義。 人類fascin1基因?qū)儆趂ascin家族，其蛋白質(zhì)編碼產(chǎn)物是一種分子量為55 kDa的細胞骨架蛋白，可與F肌動蛋

4、白結合，定位于細胞質(zhì)張力纖維和細胞膜皺褶( ruffles)邊緣與細胞的運動、癌細胞的轉(zhuǎn)移有密切關系的公狀偽足、微棘(microspikes)的核心肌動蛋白束中。細胞內(nèi)fascin1基因表達上調(diào)引起細胞間連接發(fā)生解離，同時細胞的運動也相應增加。而將fascin1基因轉(zhuǎn)染至fascin l基因低表達的結直腸癌細胞系SW1222中，結果細胞膜表面突起增多，細胞分化程度降低，細胞運動性增強。Fascin蛋白在胃癌中表達明顯增高，它的高表達與胃

5、癌的浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移、TNM分期和復發(fā)密切相關。有研究表明在肺癌中TGF-β1可誘導fascinl基因表達上調(diào)，且TGF-β1和fascinl蛋白都與肺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移有關，但是目前TGF-β與fascinl在胃癌侵襲與轉(zhuǎn)移中是否存在調(diào)控關系尚未見文獻報道。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年來發(fā)展起來的一種新技術，由于它能特異而有效地阻斷靶基因的表達，目前被廣泛應用于各種腫瘤的研究。我們構建了針

6、對Fascinl的短發(fā)夾RNA(shortharpin RNA，shRNA)真核表達載體并首次轉(zhuǎn)染人胃癌細胞MKN45，觀察抑制fascinl表達前后，TGF-β1作用對胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，并對其機制作初步探討。 目的：研究TGF-β1對fascinl基因表達的影響，以及fascinl在TGF-β促胃癌侵襲與轉(zhuǎn)移中的作用。探討以fascinl為靶的胃癌基因治療以及進一步揭示TGF-B1促胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移機制提供理論和實驗依據(jù)。

7、 方法： 1.通過細菌轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切、凝膠電泳、基因測序鑒定和基因重組技術等方法構建針對Fascinl的RNAi質(zhì)粒pGen-1-FSCN1和陰性對照質(zhì)粒pGen-1-con。 2.利用脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染技術轉(zhuǎn)染人胃癌細胞MKN45，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定抑制fascinl表達的胃癌細胞模型(pGen-1-FSCN1細胞)；分別采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應( RT-PCR)和Western blotting檢測RNAi

8、組(siFascinl)、對照組(CON)及未轉(zhuǎn)染組(NT)三組細胞中Fascinl的表達。 3.以10ng/ml的TGFβ1處理siFascinl，CON，NT三組胃癌細胞，觀察處理前后各組細胞生物學行為的變化，采用MTT比色法測定細胞的黏附能力，Boyden小室測定法測定轉(zhuǎn)染細胞的遷移能力和侵襲能力；腹腔移植法建立裸鼠胃癌細胞轉(zhuǎn)移模型。 4.分別瞬時轉(zhuǎn)染smad2，smad4的siRNA(small interfer

9、ing RNA)，檢測smad依賴通路在TGF-β誘導fascinl促胃癌浸潤與轉(zhuǎn)移中的作用；應用JNK，Erk和P38通路的特異性抑制劑檢測smad非依賴通路在TGF-β誘導fascinl促胃癌浸潤與轉(zhuǎn)移中的作用。 結果： 1.TGF-β1(10ng/ml)在作用于MKN45細胞24小時后，fascinl基因表達約為0小時的2.2倍。 2.限制性酶切及基因測序證實成功構建了針對fascinl基因的RNAi載體p

10、Gen-1-FSCNl。經(jīng)G418篩選，RT-PCR及Western blotting鑒定，成功建立了穩(wěn)定抑制fascinl基因表達的胃癌細胞模型。 3.與CON和NT比較，siFascinl細胞的黏附能力、遷移能力、侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力明顯降低(p<0.05)：三組細胞經(jīng)TGF-β1(10ng/ml)預處理后，其中CON與NT細胞黏附能力、遷移能力、侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力明顯增高(p<0.05)；而在siFascinl組，TGF-β

11、1處理前后細胞黏附能力、遷移能力、侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力無明顯變化( p>0.05)0 4.分別瞬時轉(zhuǎn)染smad2，smad4的siRNA于MKN45細胞中，予TGF-β1處理后，經(jīng)western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，MKN45中smad2，smad4的表達水平較未轉(zhuǎn)染前減少約70％，而在干擾smad2，smad4后，MKN45細胞中的fascinl表達無明顯變化；選用JNK，Erk和P38通路的特異性抑制劑，SP600125

12、，PD98095和SB203580分別預孵育MKN45細胞1h，結果發(fā)現(xiàn)：SP600125和PD98095組予TGF-β1處理24小時后，fascinl的表達明顯降低(p<0.05)，而P38通路的特異性抑制劑SB203580對fascinl的表達無明顯影響。 結論： 1.首次證實，在胃癌細胞MKN45中fascinl基因表達受外源性TGF-β1(10ng/ml)調(diào)控。 2.成功構建了針對fascinl基因的RN