EGFL7誘導EMT促進胃癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移機制的研究.pdf

1、背景:
　　胃癌是人類常見的惡性腫瘤之一，最新數(shù)據(jù)顯示其發(fā)病率及死亡率高居惡性腫瘤前列，導致了重大的公共健康負擔。雖然對胃癌的治療取得了顯著的進步，使患者的總體生存期得以提高，但是復發(fā)和轉(zhuǎn)移使胃癌患者的五年生存率仍然很低。而且大多數(shù)新診斷的胃癌患者已表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移性疾病，這使得對胃癌的治療仍然是腫瘤學中的重要難題之一。
　　近年來發(fā)現(xiàn):表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域7(Epidermal growthfactor-like domain-

2、containing protein7，EGFL7)可明顯增強細胞運動遷移能力，是重要的運動刺激因子和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子。早期研究表明，EGFL7是一種內(nèi)皮細胞源性的調(diào)節(jié)血管形成的分泌因子。最近的研究報道顯示，EGFL7在多種腫瘤組織和腫瘤細胞系中表達，包括腎癌，惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤，肝癌和結(jié)腸癌。我們前期預實驗結(jié)果顯示，在胃癌組織中也有EGFL7的表達，而且其表達與病理組織分化程度、臨床進展、預后和轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。因此，EGFL7可能作為預測癌

3、癥進展和轉(zhuǎn)移的新分子標記。然而它在胃癌中的具體作用機制目前尚不清楚，有必要進行下一步深入研究。
　　腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多步驟的過程，其中極化上皮細胞被轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細胞觸發(fā)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是轉(zhuǎn)移過程中間重要的環(huán)節(jié)。EMT賦予細胞間充質(zhì)表型從而增加細胞的侵襲和遷移能力，啟動轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應。已有研究表明，表皮生長因子(EGF)誘導EMT的活化促進了腫瘤細胞的侵襲和遷移

4、。與EGF有相似之處，EGFL7包含2個EGF樣結(jié)構(gòu)域。然而，EGFL7是否通過這兩個結(jié)構(gòu)域或者其中一個結(jié)構(gòu)域來調(diào)控EMT，促進癌細胞轉(zhuǎn)移仍有待確定。此外，EGFL7在胃癌(gastric cancer, GC)中通過EMT調(diào)節(jié)的分子機制仍是未知的，目前未見相關(guān)文獻報道。
　　目的:
　　1、研究沉默EGFL7基因?qū)ξ赴┘毎鸅GC823的侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學行為的影響。
　　2、研究EGFL7過表達及缺失相關(guān)結(jié)構(gòu)域?qū)ξ赴?/p>

5、細胞MKN28侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學行為的影響。
　　3、探究EGFL7誘導EMT促進胃癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機制。
　　方法:
　　1、研究沉默EGFL7基因?qū)ξ赴┘毎鸅GC823侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學行為的影響
　　(1)運用Western-blotting和Real-Time PCR檢測EGFL7在胃癌細胞株（BGC823、SGC7901、MKN28和MKN45）和胃黏膜正常細胞株GES-1中的表達，篩選出EGFL7高

6、表達胃癌細胞株。
　　(2)構(gòu)建EGFL7干擾質(zhì)粒載體(pGPU6/GFP/Neo-EGFL7-shRNA)及陰性對照質(zhì)粒載體(pGPU6/GFP/Neo-nonspecific-shRNA);建立EGFL7基因沉默的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系。
　　(3)通過侵襲實驗、遷移實驗和劃痕實驗比較各實驗細胞系的侵襲性和轉(zhuǎn)移性。
　　(4)運用MTT實驗和細胞平板克隆形成實驗觀察腫瘤細胞增殖和生長的情況。
　　(5)使用流式細胞術(shù)

7、檢測腫瘤細胞失巢凋亡的情況。
　　(6)裸鼠成瘤實驗:觀察裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長情況;解剖裸鼠并切取移植瘤，觀察腫瘤細胞向遠處轉(zhuǎn)移的情況，制作HE切片觀察腫瘤的病理形態(tài)特征。
　　2、研究EGFL7過表達及缺失相關(guān)結(jié)構(gòu)域?qū)ξ赴┘毎鸐KN28侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學行為的影響
　　(1) Western-blotting和Real-Time PCR檢測EGFL7在胃癌細胞株（BGC823、SGC7901、MKN28和MKN45）

8、和胃黏膜正常細胞株GES-1中的表達，篩選出EGFL7低表達胃癌細胞株。
　　(2)構(gòu)建針對EGFL7過表達的突變質(zhì)粒載體，然后在這突變的載體基礎(chǔ)上進行缺失結(jié)構(gòu)域質(zhì)粒載體的構(gòu)建，分別缺失EMI(簡稱:⊿EMI)、EGF(簡稱:⊿EGF)、EGF-ca結(jié)構(gòu)域(簡稱:⊿EGF-ca)，得到pGCMV/MCS/IRES/EGFP/Neo-EGFL7+Flag、pGCMV/MCS/IRES/EGFP/Neo-⊿ EMI+Flag、pGCM

9、V/MCS/IRES/EGFP/Neo-⊿ EGF+Flag、pGCMV/MCS/IRES/EGFP/Neo-⊿EGF-Ca+Flag質(zhì)粒載體;分別轉(zhuǎn)染至EGFL7低表達胃癌細胞株中，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系。
　　(3)通過侵襲實驗、遷移實驗和劃痕實驗比較各細胞系的侵襲性和轉(zhuǎn)移性。
　　(4)運用MTT實驗和細胞平板克隆形成實驗觀察腫瘤細胞增殖和生長的情況。
　　(5)使用流式細胞術(shù)檢測腫瘤細胞失巢凋亡的情況

10、。
　　(6)裸鼠成瘤實驗:觀察裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長情況;解剖裸鼠并切取移植瘤，觀察腫瘤細胞向遠處轉(zhuǎn)移的情況，制作HE切片觀察腫瘤的病理形態(tài)特征。
　　3、探究EGFL7誘導EMT促進胃癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機制
　　(1)觀察EGFL7基因沉默及EGFL7過表達后胃癌細胞的形態(tài)變化。
　　(2)收集臨床胃癌及癌旁組織標本79例，采用免疫組織化學方法檢測并分析EGFL7與EMT相關(guān)分子(E-Cadherin、Vime

11、ntin和Snail)之間的相關(guān)性。
　　(3)運用Real-Time PCR檢測EGFL7基因沉默和EGFL7過表達及其缺失結(jié)構(gòu)域的細胞系中的EMT相關(guān)分子(E-Cadherin、Vimentin和Snail)、侵襲轉(zhuǎn)移指標(MMP-9)和血管新生指標(VEGF)的mRNA表達水平。
　　(4)使用Western-blotting檢測EGFL7基因沉默、EGFL7過表達及其缺失結(jié)構(gòu)域的細胞系中的EMT相關(guān)分子(E-Cadh

12、erin、Vimentin和Snail)、侵襲轉(zhuǎn)移指標(MMP-9)和血管新生指標(VEGF)的蛋白表達水平以及EGFR、ERK和AKT的總表達及磷酸化水平。
　　(5)先用EGF受體(EGFR)抑制劑AG1478處理EGFL7高表達細胞株(BGC823和MKN28-EGFL7)，再用Western-blotting檢測EMT相關(guān)分子(E-Cadherin、Vimentin和Snail)、侵襲轉(zhuǎn)移指標(MMP-9)和血管新生指標(

13、VEGF)的蛋白表達水平以及EGFR、ERK和AKT的總表達及磷酸化水平;通過遷移實驗和劃痕實驗比較抑制劑處理前后的細胞運動情況的變化。
　　結(jié)果:
　　1、沉默EGFL7基因能夠降低胃癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力
　　(1)EGFL7在胃癌細胞BGC823中表達量最高;EGFL7基因沉默的穩(wěn)定胃癌細胞系建立成功。
　　(2)EGFL7基因沉默能夠誘導胃癌細胞失巢凋亡，抑制胃癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，但不能影響胃癌細胞的增殖

14、和生長。
　　(3)與對照組比較，EGFL7基因沉默組的裸鼠體內(nèi)腫瘤肝轉(zhuǎn)移數(shù)目減少。
　　2、EGFL7過表達能夠增強胃癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，EGF結(jié)構(gòu)域是EGFL7的效應結(jié)構(gòu)域
　　(1)EGFL7在胃癌細胞MKN28中表達量最低;EGFL7過表達及缺失結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定胃癌細胞系建立成功。
　　(2)EGFL7過表達能夠提高胃癌細胞的失巢凋亡抵抗能力，抑制凋亡，促進胃癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，但不能影響胃癌細胞的增殖和

15、生長。
　　(3)在缺失EGF結(jié)構(gòu)域后能升高胃癌的失巢凋亡，抑制胃癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，說明EGF結(jié)構(gòu)域是EGFL7的效應結(jié)構(gòu)域。
　　(4)與對照組比較，EGFL7過表達組的裸鼠體內(nèi)腫瘤肝轉(zhuǎn)移數(shù)目增加。
　　3、EGFL7通過AKT的磷酸化促進胃癌細胞的EMT
　　(1)EGFL7表達高的細胞株細胞形態(tài)顯示為細胞間緊密連接減少和典型的梭形間質(zhì)細胞形態(tài)，而EGFL7表達低的細胞株的細胞形態(tài)呈小細胞大小和鵝卵石樣的形

16、狀，細胞間緊密排列呈現(xiàn)典型的上皮細胞樣形態(tài)。
　　(2)采用Spearman相關(guān)性檢驗進行相關(guān)分析。EGFL7表達與Vimentin的表達成正相關(guān)(r=0.620，P＜0.05)，與Snail的表達亦成正相關(guān)(r=0.492，P＜0.05)。但是，它的表達與E-Cadherin的表達呈負相關(guān)(r=-0.304，P＜0.05)。
　　(3)EGFL7基因沉默能夠降低EGFR和AKT磷酸化水平。
　　(4)EGFL7基因沉

17、默能夠抑制Vimentin、Snail、MMP-9和VEGF的表達，而促進E-Cadherin的表達。
　　(5)EGFR的抑制劑能夠降低EGFR和AKT的磷酸化水平。
　　(6)EGFR抑制劑能夠抑制Vimentin、Snail、MMP-9和VEGF的表達，而促進E-Cadherin的表達。
　　結(jié)論:
　　1、沉默EGFL7基因的胃癌細胞的失巢凋亡抵抗能力減弱，侵襲和轉(zhuǎn)移能力降低，但不能影響胃癌細胞的增殖和生