Survivin反義寡核苷酸對肝細(xì)胞癌凋亡和化療藥物敏感性的實驗研究.pdf

1、目的：肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。由于我國是肝炎高發(fā)國家，近年來HCC的發(fā)病率和死亡率有逐年升高的趨勢。HCC占原發(fā)性肝癌的90％以上。由于其具有侵潤性強(qiáng)，易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性，目前包括手術(shù)、放療、化療等各種治療方法的效果均不佳。對肝細(xì)胞癌病因、發(fā)病機(jī)制、生物學(xué)特性以及新的治療方法的探討已成為腫瘤學(xué)的熱點(diǎn)課題。 Survivin是近年來發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族

2、的新成員，它可以抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，在幾乎所有的惡性腫瘤中具有豐富的表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)。根據(jù)這一特性與之相關(guān)的腫瘤基因治療成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。本研究通過反義核酸技術(shù)將survivin反義寡核苷酸(ASODN)轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞，探討其對SMMC-7721細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討其對常見化療藥物的協(xié)同作用，為肝細(xì)胞癌的治療尋找新的途徑提供試驗依據(jù)。 方法：設(shè)計并合成特異性靶向survivin的ASODN

3、及正義寡核苷酸(SODN)，將其轉(zhuǎn)入SMMC-7721細(xì)胞，設(shè)空白對照組、空脂質(zhì)體對照組、150nmol/LSODN對照組、150nmol/LASODN組、500nmol/LASODN組與1000nmol/LASODN組。倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化；透射電鏡下觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變；應(yīng)用MTT法檢測不同轉(zhuǎn)染濃度、不同轉(zhuǎn)染時間下各組細(xì)胞的生長抑制率；應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)(FCM)檢測各組細(xì)胞的增殖與凋亡指數(shù)；用無牛清、

4、無抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基配制氟脲苷、吡柔比星與順鉑的工作液，設(shè)空白對照組、1000nmol/LASODN組、化療藥+1000nmol/LASODN組，化療藥最終濃度為1μg/ml，作用48小時，MTT法檢測各組的生長抑制率，并計算相互作用指數(shù)(CDI)。應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩樣本比較采用配對t檢驗，組間顯著性檢驗采用單因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05為差異有顯著性。 結(jié)果：1倒置顯微鏡下見

5、轉(zhuǎn)染后細(xì)胞排列松散，細(xì)胞之間空隙加大，形態(tài)變圓，胞漿中顆粒較多，貼壁細(xì)胞生長較少，部分漂浮于培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液因此變得較混濁，且隨著轉(zhuǎn)染濃度的增加變化更明顯。 2透射電鏡下見轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞胞體縮小，微絨毛數(shù)量減少，胞質(zhì)濃縮，胞核局部向外呈銳角突起，核染色質(zhì)高度濃縮，電子密度增高，邊集于核膜下，有的出現(xiàn)核固縮和核碎裂，偶見凋亡小體。而正常組未見明顯凋亡改變。 3MTT法結(jié)果顯示：作用48小時后，各組生長抑制率分別為1.75±0

6、.49％、0.25±0.85％、13.25±2.06％、23.00±3.16％、33.75±5.68％。說明隨著轉(zhuǎn)染濃度的增加，細(xì)胞的抑制率明顯增加(P＜0.05)，而且有濃度依賴性；各對照組之間差異無顯著性(P＞0.05)。1000nmol/LASODN組作用24、48、72小時后細(xì)胞生長抑制率分別為18.20±3.70％、28.20±3.42％、44.60±10.21％(三組之間比較均P＜0.05)，存在時間依賴性。 4FC

7、M結(jié)果顯示：ASODN使SMMC-7721細(xì)胞的G0/G1期比例顯著降低；G2/M期比例顯著增高(P＜0.01)，使細(xì)胞阻滯于G2/M期，并且呈濃度依賴性(P＜0.01)。ASODN對SMMC-7721細(xì)胞引起了顯著的細(xì)胞凋亡，且呈濃度依賴性。1000nmol/LASODN作用48小時SMMC-7721的凋亡率最高為33.83％。 5吡柔比星、氟脲苷、順鉑聯(lián)合1000nmol/LASODN組的生長抑制率顯著高于單純化療藥物組(P

8、＜0.01)，CDI值分別為吡柔比星0.9392、氟脲苷0.8983、順鉑0.8119，均小于1，說明survivinASODN聯(lián)合上述三種化療藥對SMMC-7721細(xì)胞有協(xié)同增敏作用。 結(jié)論：1使用脂質(zhì)體包裹survivinASODN轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞SMMC-7721后，阻礙了survivinmRNA轉(zhuǎn)錄及翻譯的過程，可以抑制肝癌細(xì)胞系SMMC-7721的增殖。 2SurvivinASODN封閉survivin基因的表達(dá)，