連作穿心蓮轉(zhuǎn)錄組特征及DNA甲基化分析.pdf

1、連作障礙是指作物在同一土壤中連續(xù)多次栽培后，即使在正常的管理?xiàng)l件下，也會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)情況變差、品質(zhì)變劣、產(chǎn)量減少、病蟲(chóng)害嚴(yán)重的現(xiàn)象。目前許多中藥材存在不同程度的連作障礙，如人參、西洋參、地黃等;連作障礙已成為了一個(gè)危害甚廣且亟待解決的生產(chǎn)問(wèn)題。
　　穿心蓮來(lái)源于爵床科(Acanthaceae)植物穿心蓮[Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees]的干燥地上部分，其臨床應(yīng)用廣泛且是多種中成藥的原料，市場(chǎng)需

2、求量大。研究報(bào)道穿心蓮存在連作障礙，但現(xiàn)有研究多集中在其營(yíng)養(yǎng)體的化感作用方面，關(guān)于連作對(duì)穿心蓮植株生理生態(tài)特征的影響目前仍無(wú)報(bào)道。
　　本研究對(duì)3個(gè)連作年限（連作0年、連作1年及連作2年）穿心蓮的生長(zhǎng)指標(biāo)、生理指標(biāo)、產(chǎn)量及活性成分含量進(jìn)行測(cè)定分析，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和DNA甲基化兩個(gè)角度從分子水平上對(duì)其變化進(jìn)行研究，以期能明確連作對(duì)穿心蓮生長(zhǎng)的影響并從分子層面上對(duì)這些變化進(jìn)行初步探討。方法和結(jié)果概括如下:
　　1、連作對(duì)穿心蓮生

3、長(zhǎng)的影響
　　連作試驗(yàn)結(jié)果表明，穿心蓮植株的株高、葉總面積、葉綠素含量及產(chǎn)量隨著連作年限的增加而增加，連作1年、2年與連作0年比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);連作后穿心蓮的花期、果期比正茬提前了5～7天;穿心蓮藥材活性成分含量測(cè)定結(jié)果表明，連作組的穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量均比正茬的降低;穿心蓮葉片膜脂過(guò)氧化程度及抗氧化酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)及過(guò)氧化氫酶(CAT

4、)的活性均隨連作年限的增加而升高。
　　2、連作穿心蓮轉(zhuǎn)錄組特征研究
　　通過(guò)Illumina Hiseq2000高通量測(cè)序從穿心蓮中獲得了231，536，164條讀序，總核苷酸數(shù)達(dá)2.58G，拼接組裝后共得到平均長(zhǎng)度為1，045 bp的Unigene43，683條。對(duì)獲得的Unigene進(jìn)行功能注釋，共有10，584條Unigene被注釋到COG數(shù)據(jù)庫(kù)的24個(gè)功能類別;對(duì)獲得的Unigene進(jìn)行GO功能分類，分別有21，1

5、58條、22，596條和12，884條Unigene被注釋到生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能三大主要功能類別;此外，有8，024條Unigene可歸入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的122條代謝途徑。對(duì)3個(gè)連作穿心蓮表達(dá)譜進(jìn)行分析，從中挖掘出了8，691個(gè)差異表達(dá)基因，使用STEM軟件聚類得到了8個(gè)差異表達(dá)趨勢(shì)并對(duì)其進(jìn)行KEGG通路分析，獲得了一系列在3個(gè)連作年限間具有一定表達(dá)趨勢(shì)的通路。對(duì)與穿心蓮化學(xué)成分相關(guān)的通路進(jìn)行分析，注釋獲得參與苯丙氨酸代謝途徑

6、的8個(gè)關(guān)鍵酶、類黃酮生物合成途徑的9個(gè)關(guān)鍵酶及二萜生物合成途徑的6個(gè)關(guān)鍵酶，并明確了它們?cè)?個(gè)連作年限樣品中的表達(dá)水平。
　　3、連作穿心蓮的DNA甲基化分析
　　利用LC-MS/MS和MSAP測(cè)定了3個(gè)連作年限的穿心蓮葉片基因組DNA總甲基化水平，兩者的測(cè)定結(jié)果均表明隨著連作年限的增加，穿心蓮葉片DNA的甲基化水平逐漸降低。其中，LC-MS/MS測(cè)定的DNA甲基化水平為10.26％～13.91％，MSAP測(cè)定的甲基化水平為

7、8.20％～9.24％;此外，MSAP分析顯示，穿心蓮葉片基因組CCGG位點(diǎn)主要發(fā)生去甲基化。
　　綜上所述，本研究以穿心蓮為材料進(jìn)行了連作試驗(yàn)，明確了連作對(duì)穿心蓮生長(zhǎng)的影響;本研究還從轉(zhuǎn)錄組學(xué)和DNA甲基化的角度探討了連作對(duì)穿心蓮分子層面的影響，初步建立了穿心蓮轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)平臺(tái)并挖掘了一系列響應(yīng)連作的差異表達(dá)基因，同時(shí)也測(cè)定了連作穿心蓮葉片基因組DNA甲基化水平;對(duì)連作穿心蓮的轉(zhuǎn)錄組特征及DNA甲基化進(jìn)行分析，將有助于從分子水平上