MicroRNA-133b在結直腸癌細胞系中靶基因的篩選.pdf

1、結直腸癌(Colorectal carcinoma，CRC)是常見的消化道惡性腫瘤之一，全球CRC的發(fā)病率均呈上升趨勢。CRC的發(fā)生發(fā)展過程與眾多腫瘤相關因子的異常表達及功能改變有關。
　　miRNA是一類內源性的非編碼單鏈RNA，由22個左右核苷酸組成，其靶向抑制mRNA的翻譯或直接將其降解，使靶基因在轉錄后水平的表達受到抑制，從而起到基因表達的調控作用[1]。2003年，Michael等[2]最早報道了miRNA在人結直腸癌組

2、織和正常結直腸黏膜中的差異表達，檢測到28種miRNAs表達發(fā)生了變化，其中miR-143和miR-145在癌組織中表達較正常組織明顯降低。隨后的研究發(fā)現(xiàn)眾多miRNA參與了CRC的發(fā)生發(fā)展過程，并與CRC的診斷、分期、治療與預后等密切相關[3，4]。miRNA通過調控不同的靶基因在腫瘤中起到類似于原癌基因或抑癌基因的作用[5]。miR-133b最初被認為是一種心肌特異性的miRNA，在心肌的發(fā)育和功能維持方面起重要作用[6，7]。近年

3、有研究小組幾乎同時發(fā)現(xiàn)miR-133b在肺癌[8]、食道癌[9]、舌癌[10]、胃癌[11]、膀胱癌[12]等不同腫瘤中表達失調，并具有明確的腫瘤抑制效應。胡桂等[13，14]首次通過研究證實了miR-133b在結直腸癌組織及細胞系中的表達明顯下調，且與結直腸癌細胞的惡性程度密切相關;功能實驗進一步證實miR-133b可抑制結直腸癌細胞的侵襲和遷移，并具有明顯的細胞周期阻滯的作用;動物實驗發(fā)現(xiàn)在裸鼠體內同樣有明確的腫瘤抑制作用。盡管如此

4、，miR-133b在CRC中的作用機制仍不明確，需進行進一步研究。
　　研究目的:本實驗在前期實驗的基礎上，通過細胞轉染建立miR-133b高表達的結直腸癌細胞系，并與未轉染的結直腸癌細胞對比進行基因芯片高通量測序及基因的功能注釋，篩選出miR-133b在CRC中可能相關的靶基因。
　　材料與方法:本研究選用兩種購自ATCC細胞庫的結直腸癌細胞系SW620及HT29，將細胞分成4組進行細胞轉染。實驗分組為miR-133b m

5、imics轉染組(用Lipofectamine2000即Lipo2000轉染miR-133b mimics)，NC轉染組(用Lipo2000轉染miR negativecontrol)，空白組(Blank，加入與前2組等量的Lipo2000，無miRNA片段)，對照組（Control，細胞常規(guī)培養(yǎng)，不加入Lipo2000和miRNA片段）。將轉染后細胞進行倒置熒光顯微鏡下的熒光顯色情況觀察，并采用real-time PCR的方式檢測各組

6、細胞中miR-133b的表達情況，評價其轉染效率。將成功轉染了miR-133b mimics的兩種細胞分別與相應細胞的NC轉染組配對進行Agilent人全基因表達譜芯片的高通量測序。檢測出的差異基因初步根據基因在miR-133b組中表達下調、P＜0.05、FC(abs)≥1.5這幾個條件進行篩選，然后進一步與miRNA靶基因預測軟件（miRBase，PicTar，TargetScan）進行比對，最終篩選出的基因行GO分子功能和Pathw

7、ay信號通路富集度統(tǒng)計分析。
　　結果:
　　1.轉染結直腸癌細胞系后miR-133b表達的檢測
　　miR-133b mimics轉染CRC細胞系SW620及HT29的最佳濃度為80nM，轉染效率可達50％左右。通過Real-time PCR法檢測miR-133bmimics轉染組，NC轉染組，空白組及對照組中miR-133b的相對表達率(RQ)。以對照組中miR-133b相對表達率為1，以RQ=2-ΔΔCT為公式計

8、算其他各組的RQ值，在SW620細胞系中，miR-133b mimics轉染組miR-133b的表達(502.461±16.837)顯著上調(P=0.000563);NC轉染組miR-133b的表達(0.841±0.305)無明顯改變(P=0.537648);空白組miR-133b的表達(0.803±0.284)無明顯改變(P=0.431831); NC轉染組與空白組比較miR-133b的表達無明顯差異(P=0.910242)。在HT2

9、9細胞系中，miR-133b mimics轉染組miR-133b的表達(332.386±13.039)顯著上調(P=0.000773); NC轉染組miR-133b的表達(0.870±0.219)無明顯改變(P=0.490357);空白組miR-133b的表達(0.767±0.356)無明顯改變(P=0.451923);NC轉染組與空白組比較miR-133b的表達無明顯差異(P=0.807844)。
　　2.人全基因表達譜篩選靶基

10、因的分析
　　運用Agilent人全基因表達譜芯片標記出的差異基因數，SW620細胞系為34364個，HT29細胞系為39443個。符合在miR-133b組中表達下調、P＜0.05、FC(abs)≥1.5這幾個標準的差異基因數，SW620細胞系有346個，HT29細胞系有354個。運用三種不同的microRNA靶點預測軟件（miRBase，PicTar，TargetScan）最終篩選出9個相關靶基因，SW620細胞系有7個靶基因:

11、latent transforming growth factorbeta binding protein1(NM_206943),contactin associated protein1(NM_003632), human immunodeficiency virus type I enhancer bindingprotein2(NM_006734),dual specificity phosphatase5(NM_004419)

12、,connective tissue growth factor(NM_001901),yippee-like2(Drosophila)(NM_001005404),GABA(A) receptor-associated protein like1(NM_031412)。HT29細胞系有2個靶基因:family with sequencesimilarity19(chemokine(C-C motif)-like), member A5

13、(NM_015381),beta-1,3-N-acetylgalactosaminyltransferase1(globoside blood group)（NM_001038628）。
　　將以上9個靶基因經分子功能注釋系統(tǒng)(Molecule AnnotationSystem，MAS3.0)進行相應的GO分子功能和Pathway信號通路富集度統(tǒng)計分析。B3GALNT1主要定位在高爾基體膜上，與鎂離子結合有關，參與部分糖蛋白的代謝

14、過程，并有轉移酶活性。CNTNAP1主要定位于細胞膜上，為一種細胞粘附分子，有受體活性，有信號傳導功能，并與SH2/SH3結合有關。CTGF主要定位于細胞膜上或細胞間質中，是一種生長因子，與整合素、胰島素樣生長因子、成纖維細胞生長因子等信號通路有關，還與細胞形態(tài)、運動、粘附、遷移、分化，表皮生長，組織形成，血管生成，骨化、軟骨縮合等多種生物學過程有關。DUSP5定位于細胞核，主要參與氨基酸去磷酸化，還有酪氨酸磷酸酶、MAPK磷酸酶、水解

15、酶等活性，并與MAPK信號通路有關。GABARAPL1在細胞內各處均存在，能調節(jié)自噬作用，與蛋白結合，如GABA受體、β-微管蛋白等。HIVEP2主要定位于細胞核上，與DNA連接，金屬離子的結合有關，調控轉錄過程。LTBP1定位于細胞間質、細胞質和細胞核上，與鈣離子、生長因子等結合有關，有TGF-β受體活性，并參與其信號通路。FAM19A5主要定位于細胞間質或者細胞膜上，YPEL2主要定位于細胞核上。
　　結論:1.miR-133