索拉非尼聯(lián)合放射抗肝細(xì)胞癌效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分索拉非尼聯(lián)合放射抗肝細(xì)胞癌的體外研究
　　目的:索拉非尼的多激酶抑制作用提示其與放射聯(lián)合有協(xié)同增效的潛在可能。本部分研究旨在通過(guò)兩種人肝癌細(xì)胞株（SMMC-7721，SK-HEP-1）來(lái)觀察索拉非尼與放射聯(lián)合是否對(duì)肝癌有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)以及可能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的聯(lián)合方式。方法:通過(guò)CCK-8法細(xì)胞毒性增殖實(shí)驗(yàn)繪制不同濃度索拉非尼處理48h后的肝癌細(xì)胞存活曲線，計(jì)算索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制濃度(IC)。選擇IC50（抑制細(xì)胞生長(zhǎng)5

2、0％時(shí)的藥物濃度）的10％作為克隆形成實(shí)驗(yàn)的藥物濃度。通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)比較索拉非尼在γ線照射前/后處理與單純放射后的肝癌細(xì)胞劑量效應(yīng)曲線，計(jì)算放射增敏比。
　　結(jié)果:SMMC-7721和SK-HEP-1細(xì)胞的IC50分別是4.82μM和9.55μM。故選用10％的IC50，即0.5μM和1μM分別作為兩種肝癌細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)的藥物濃度。索拉非尼對(duì)兩種肝癌細(xì)胞株的放射敏感性改變因索拉非尼與放射聯(lián)合方式的不同而異。索拉非尼后處理(R-

3、＞S)明顯增加了SMMC-7721細(xì)胞的放射敏感性(SER=1.21)，但幾乎不改變SK-HEP-1細(xì)胞的存活曲線斜率(SER=1.00)。索拉非尼預(yù)處理(S+R)則使兩種肝癌細(xì)胞的存活曲線在較高照射劑量區(qū)域的斜率都出現(xiàn)明顯增加（β值增加），SMMC-7721和SK-HEP-1的SER分別是1.10和1.18。
　　結(jié)論:體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了索拉非尼與放射聯(lián)合對(duì)兩種不同放射敏感性的肝癌細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的放射增敏效應(yīng)。
　　第二部分

4、索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞放射增敏效應(yīng)的機(jī)制研究
　　目的:本部分研究旨在從細(xì)胞增殖、DNA損傷及修復(fù)、細(xì)胞凋亡等多個(gè)可能影響放射敏感性的方面，來(lái)闡述索拉非尼與放射聯(lián)合在肝癌細(xì)胞中產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的潛在機(jī)制。
　　方法:通過(guò)Western blot方法檢測(cè)索拉非尼聯(lián)合放射作用于肝癌細(xì)胞對(duì)放射所誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖(p-ERK1/2)、DNA損傷修復(fù)(p-Ku70、p-BRCA1)、細(xì)胞凋亡(p-NF-KB)和新生血管形成(p-VEG FR2)

5、等多個(gè)方面的蛋白表達(dá)水平的調(diào)控。通過(guò)微核實(shí)驗(yàn)考察索拉非尼是否增加了放射所誘導(dǎo)的DNA損傷。通過(guò)AnnexinⅤ/PI流式細(xì)胞術(shù)和caspase-3酶活性檢測(cè)，觀察索拉非尼對(duì)放射所誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:索拉非尼與放射聯(lián)合作用于肝癌細(xì)胞可以有效地抑制由放射誘導(dǎo)的VEGFR2磷酸化及其下游信號(hào)傳導(dǎo)通路中ERK的激活。索拉非尼與放射聯(lián)合較單純放射在肝癌細(xì)胞中增加了細(xì)胞微核率、同時(shí)又抑制雙鏈斷裂HR和NHEJ修復(fù)途徑的關(guān)鍵蛋白BR

6、CA1和Ku70的磷酸化表達(dá)。此外，放射所誘發(fā)的NF-KB磷酸化激活可以被索拉非尼的聯(lián)合應(yīng)用所抑制，索拉非尼也顯著增加了放射后早期凋亡細(xì)胞比例和caspase-3酶活性。然而，SK-HEP-1細(xì)胞索拉非尼在放射后給藥組在以上作用機(jī)制中均有所例外，這也正解釋了這一組沒(méi)有產(chǎn)生放射增敏的結(jié)果。
　　結(jié)論:索拉非尼與放射聯(lián)用于肝癌細(xì)胞，可以抑制放射后細(xì)胞增殖，增加放射引起的DNA損傷并抑制兩種關(guān)鍵途徑的DNA修復(fù)能力，同時(shí)促進(jìn)放射誘導(dǎo)的凋

7、亡。以上多種機(jī)制共同促成了索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞的放射增敏作用。
　　第三部分索拉非尼聯(lián)合放射抗肝癌效應(yīng)的體內(nèi)研究
　　目的:本部分實(shí)驗(yàn)研究旨在觀察索拉非尼與放射聯(lián)合在肝癌荷瘤裸鼠模型中的抗腫瘤效應(yīng)。
　　方法:通過(guò)皮下接種SMMC-7721和SK-HEP-1細(xì)胞建立肝癌的荷瘤裸鼠模型。對(duì)移植瘤進(jìn)行以下分組處理:對(duì)照組、單純放射組、放射序貫聯(lián)合索拉非尼組以及索拉非尼同步聯(lián)合放射組。其中，索拉非尼給藥分為高劑量(100mg/

8、kg/d)和低劑量(30 mg/kg/d)。構(gòu)建不同處理組不同劑量點(diǎn)的腫瘤生長(zhǎng)曲線，并用Gompertz模型或Cubic模型進(jìn)行擬合。以移植瘤生長(zhǎng)達(dá)到2倍初始體積(VO)為目標(biāo)效應(yīng)，計(jì)算各處理組的腫瘤生長(zhǎng)延遲天數(shù)(TGD)并用相應(yīng)的對(duì)照組進(jìn)行標(biāo)化。根據(jù)不同的放射劑量和標(biāo)化的TGD產(chǎn)生劑量效應(yīng)曲線，計(jì)算劑量修飾因子(DMF)。
　　結(jié)果:對(duì)于5MMC-7721移植瘤，放射后序貫聯(lián)合索拉非尼延遲腫瘤生長(zhǎng)的作用具有劑量依賴性，即隨著索拉

9、非尼劑量加大而增加（DMF最大可達(dá)1.57）;但是，索拉非尼同步聯(lián)合放射在兩種索拉非尼劑量水平產(chǎn)生相似的腫瘤生長(zhǎng)延遲作用（DMF為1.4左右）。對(duì)于SK-HEP-1移植瘤，索拉非尼同步聯(lián)合放射產(chǎn)生藥物劑量依賴性的生長(zhǎng)抑制作用（DMF最大可達(dá)1.82）;而放射后序貫聯(lián)合索拉非尼也增加了放射的效應(yīng)，但其延遲腫瘤生長(zhǎng)的作用不隨索拉非尼劑量的增加而增加（DMF為1.5左右）。
　　結(jié)論:索拉非尼與放射聯(lián)合在肝癌移植瘤中可產(chǎn)生顯著的放射增敏