沙門菌屬stn基因LAMP快速檢測方法的研究.pdf

1、沙門菌是對人類和動物健康都能構(gòu)成危害的一類致病菌，據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，自二十世紀(jì)末以來，沙門菌對人類健康的威脅越來越大，已引起全球衛(wèi)生組織的重視。近年來，隨著進(jìn)出口貿(mào)易日益繁榮，也使得沙門菌的全球性傳播成為可能，致使口岸出入境樣本檢測工作量急劇增加;而各口岸出入境工作人員結(jié)構(gòu)組成復(fù)雜，流動快，難以控制，因此建立快速、準(zhǔn)確、簡便的檢測方法保證進(jìn)出口的安全性迫在眉睫。
　　本研究目的:擬以沙門菌腸毒素基因(Salmonella ent

2、erotoxin gene，stn)作為靶基因，建立檢測沙門菌的DNA環(huán)介導(dǎo)的恒溫擴(kuò)增法《loop-mediated isothermalamplification of DNA，LAMP)，對沙門菌屬進(jìn)行特異性檢測，建立切實(shí)可行的快速沙門菌檢測技術(shù)并初步應(yīng)用。
　　方法:1.在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索沙門菌屬stn基因核苷酸序列，提交到PrimerExplorerV4設(shè)計相應(yīng)的LAMP引物，并通過Oligo6.0進(jìn)行分析，以確

3、保引物之間無二聚體形成;應(yīng)用BLAST程序，通過GenBank對引物及擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行同源性對比，經(jīng)篩選獲得特異性內(nèi)外引物各一對。
　　2.利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，使目的基因高效擴(kuò)增。
　　3.對LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，在反應(yīng)體系中添加SYBR-GreenⅠ熒光染料，結(jié)合顯色反應(yīng)，使結(jié)果觀察直觀準(zhǔn)確，能真正實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速簡便檢測。
　　4.用沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株和非沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株

4、檢測方法的特異性和敏感性。與表型檢測方法顯色培養(yǎng)基法同時檢測肉、蛋、奶、水產(chǎn)品等樣品共計100份，檢測該方法的實(shí)用性。
　　結(jié)果:1.本研究建立的以沙門菌stn基因LAMP快速檢測方法，LAMP反應(yīng)體積25μl，在最佳擴(kuò)增溫度63℃恒溫條件下，時間60min內(nèi)完成對沙門氏菌的檢測。
　　2.檢測沙門氏菌DNA最低濃度極值為1fg/ml，檢測沙門氏菌菌液最低濃度極值為10cfu/ml。對沙門氏菌株陽性檢出率100％，非沙門氏菌

5、株檢測均為陰性。
　　3.100份檢驗(yàn)、檢疫樣品檢測結(jié)果與表型檢測方法顯色培養(yǎng)基檢測結(jié)果對比，一致率100％。
　　結(jié)論:本研究建立了沙門菌屬stn基因LAMP檢測方法，并應(yīng)用于沙門菌屬標(biāo)準(zhǔn)株檢測及疑污染沙門菌的檢驗(yàn)檢疫樣品檢測中，結(jié)果表明該法敏感性、特異性高，簡便快速，不需要昂貴的儀器設(shè)備，操作簡單，不易出現(xiàn)DNA污染。加入熒光染料顯色后，結(jié)果更易于觀察。確實(shí)能達(dá)到快速檢測沙門菌的目的，是一種適合口岸及基層檢驗(yàn)、檢疫部門使