生物質譜離子化源輔助配件研制及蛋白質組絕對定量新方法研究.pdf

1、隨著蛋白質組學技術和方法研究的深入，蛋白組學研究已由原來的兩譜三圖三庫進一步向蛋白質組深度覆蓋和定量研究發(fā)展。蛋白質組深度覆蓋是蛋白質組注釋基因組、發(fā)現診斷標志物、藥物靶標和關鍵蛋白質分子的前提和基礎，而蛋白質組定量信息的獲得有利于蛋白質功能的發(fā)現和深度解析。蛋白質組深度覆蓋的含義包括蛋白質組中蛋白質鑒定的深度覆蓋和蛋白質序列的長度覆蓋。隨著液相色譜及質譜技術的迅速發(fā)展，液相色譜-質譜聯(lián)用技術已經成為實現蛋白質組深度覆蓋和蛋白質組定量的

2、常用手段。然而由于在蛋白質組分析過程中，存在蛋白質樣品制備時產生的損耗、樣本的不完全酶解、質譜靈敏度低等問題，影響了低豐度蛋白的鑒定，因而限制了蛋白質組覆蓋度的提高和更多蛋白定量信息的獲取。另外，采用化學合成方法制備內標肽段，價格昂貴、產量低，而體外標記SILAC方法和體內標記iTRAQ或TMT價格昂貴，限制了定量蛋白質組技術的廣泛應用。
　　針對蛋白質組學研究中存在的問題，本論文首先在質譜靈敏度方面，研制了一種新型離子源輔助部件

3、，以提高質譜靈敏度與穩(wěn)健性;其次，針對實際樣本酶解不完全問題，研究了通過提高蛋白水解酶的量以增加酶切速度和效率的可行性;最后，針對蛋白質組絕對定量方法中存在的問題，首先基于金屬標簽的價格低廉的特點，和選擇離子監(jiān)測質譜高靈敏度的特點，發(fā)展了一種絕對定量新方法。其次發(fā)展了反相色譜填料（C18填料）輔助的18O標記定量肽段串聯(lián)體蛋白（quantification concatamer，QconCAT）結合液-質聯(lián)用的蛋白質組絕對定量新方法。<

4、br>　　本論文由四章組成。第一章概述了蛋白質組學的研究現狀、質譜離子源研究現狀以及蛋白質酶解效率對蛋白質組研究的影響、金屬標記及18O標記結合高效液相色譜-質譜定量方法的最新進展，并在目前研究背景下提出了本課題的研究內容。
　　在第二章，研制了一種離子源輔助部件，不僅提高了目前使用電噴霧離子源的流速，并且增加了靈敏度和噴霧的穩(wěn)定性。輔助部件設計時，首先通過電動力學方法模擬對影響離子源靈敏度的兩個因素進行優(yōu)化，然后通過制作輔助部件

5、提高了離子化效率及傳輸效率，進而提高了質譜的靈敏度。首先用多場耦合分析計算軟件對離子源輔助部件形狀進行設計，之后用標準肽段樣品對輔助部件性能進行檢驗。裝有輔助部件的離子源流速設為1-2μL/min后，信號比未使用輔助部件離子源提高了5.6倍，即信噪比增加為原來的2.8倍;定量限比未使用輔助部件納升源降低65％，且流速保持在在1-2μL/min，增加了質譜分析的穩(wěn)定性。
　　在第三章，我們將金屬標簽與選擇離子監(jiān)測技術集合起來，建立了

6、一種蛋白質絕對定量新方法。首先考察了多反應離子監(jiān)測質譜技術和選擇離子監(jiān)測質譜檢測的靈敏度，表明在分析組成簡單的樣品時選擇離子檢測質譜技術有更好的靈敏度;其次考察了金屬標簽用于定量蛋白質組學的可行性，對標記效率、標記歧視性、標記穩(wěn)定性和金屬標記肽段色譜保留行為進行了考察。實驗結果表明金屬標記可以用于絕對定量。采用建立的蛋白質絕對定量新方法對騰沖嗜熱菌蛋白進行定量，結果表明絕對定量方法的靈敏度高，定量限為1 fmol;線性范圍為1fmol～

7、500 fmol時，線性范圍內R2值大于0.99，具有良好的線性;測定的標準肽段回收率為117.01％，說明該方法具有較高的準確度;將該方法應用于騰沖嗜熱菌中烯醇酶蛋白的定量分析，相對標準偏差為5.47％，表明定量結果可信。結果表明該定量方法可以用于蛋白質組絕對定量分析，是簡單樣本的一種新的方法選擇
　　在第四章，我們發(fā)展了一種通過增大酶量的蛋白質樣本快速、高效酶切方法，并基于這種酶切方法發(fā)展了18O標記QconCAT結合液-質聯(lián)

8、用的目標蛋白質組絕對定量新方法。在溶液狀態(tài)下，通過增加蛋白酶量至酶與底物質量比為1∶1時，可在37℃下2小時內實現對蛋白樣品的完全酶切，且未發(fā)生自切現象。對酶切后的多肽混合物，通過反相色譜柱分離，實現蛋白酶及酶切肽段的分離，并回收了蛋白酶。進一步通過對回收后的蛋白酶酶切效率進行考察，發(fā)現蛋白質的酶切效率沒有降低，可重復使用。使用該方法的優(yōu)點是與一般酶切方法相同，容易掌握，操作簡單，酶切時間短、效率高?；谠摲椒ǖ?8O標記方法不僅標記時