基于肺炎衣原體核糖核酸酶HII酶促反應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性分型檢測(cè)技術(shù).pdf

1、單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)是一種在基因組水平上由于單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性。SNP密度高，遺傳穩(wěn)定，非常適合構(gòu)建最精細(xì)的遺傳圖譜；SNP連鎖分析能夠確定致病基因的變異，反映個(gè)體之間的遺傳差異，為基因診斷、基因治療、個(gè)性化藥物的開(kāi)發(fā)和使用提供遺傳信息。目前已經(jīng)發(fā)展多種SNP分型檢測(cè)技術(shù)，但是很多技術(shù)需要精密儀器，而且檢測(cè)成本比較高。開(kāi)發(fā)操作簡(jiǎn)便的低成本SNP分型技術(shù)是眾多

2、研究者追尋的目標(biāo)。 RNaseH是一類特異性降解RNA-DNA/DNA或者RNA/DNA雜合雙鏈中RNA鏈的核糖核酸酶，酶切產(chǎn)生具有5’磷酸末端和3’羥基末端的RNA片段。根據(jù)氨基酸序列特征可將RNaseH分為兩個(gè)主要家族，1型RNaseH和2型RNaseH。 衣原體(Chlamydiapneumoniae)的基因組序列分析表明衣原體沒(méi)有編碼1型RNaseH的基因，但有兩個(gè)序列不同的編碼2型RNaseH的基因：CP064

3、5和CP0782，(表達(dá)的蛋白分別命名為CpRNaseHII和CpRNaseHIII)?？寺pRNaseHII和CpRNaseHIII基因，表達(dá)并純化得到有活性的CpRNaseHII和CpRNaseHIII蛋白。CpRNaseHII和CpRNaseHIII的活性有所不同。CpRNaseHII在12-bpRNA/DNA底物的多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生切割，而CpRNaseHIII只在這種底物的一個(gè)位點(diǎn)發(fā)生切割；CpRNaseHII酶切12-bpRNA

4、/DNA底物的最適Mg2+或Mn2+濃度分別為1mM和0.1mM，并且Mg2+的活性促進(jìn)作用高于Mn2+，而CpRNaseHIII酶切12-bpRNA/DNA底物的最適Mg2+或Mn2+濃度均為10mM。CpRNaseHII能夠酶切21-bpDNA-rN1-DNA/DNA嵌合雙鏈，而且酶切效率不受核糖核苷酸類型的影響，而CpRNaseHIII不能夠切割這種底物；CpRNaseHII酶切21-bpDNA-rN1-DNA/DNA底物的最適鎂

5、離子濃度是10mM。 在DNA-rN1-DNA/DNA底物的不同位點(diǎn)引入錯(cuò)配堿基，研究CpRNaseHII酶切攜帶錯(cuò)配堿基的DNA-rN1-DNA/DNA嵌合底物的酶切速率。發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)孜飻y帶錯(cuò)配堿基時(shí)，CpRNaseHII酶切錯(cuò)配底物的酶促反應(yīng)速度低于正確配對(duì)底物，即錯(cuò)配堿基的存在能夠降低CpRNaseHII酶促反應(yīng)速度。錯(cuò)配堿基位于底物不同位點(diǎn)時(shí)，CpRNaseHII酶切錯(cuò)配底物的酶促反應(yīng)速度有很大不同。錯(cuò)配堿基距離核糖核苷酸越

6、遠(yuǎn)，CpRNaseHII酶切錯(cuò)配底物的酶促反應(yīng)速度越接近正確配對(duì)底物。錯(cuò)配堿基位于核糖核苷酸位點(diǎn)(0)或者位于緊挨核糖核苷酸的脫氧核糖核苷酸位點(diǎn)(-1或者+1)時(shí)，CpRNaseHII酶切錯(cuò)配底物的酶促反應(yīng)速度最低。因此CpRNaseHII酶切錯(cuò)配底物的酶促反應(yīng)速度與錯(cuò)配堿基距離核糖核苷酸的相對(duì)距離成反比。 在0，-1或者+1位點(diǎn)引入不同的錯(cuò)配堿基，結(jié)果表明錯(cuò)配堿基位于0位點(diǎn)或者緊挨核糖核苷酸的5’端(-1)時(shí)，比起錯(cuò)配堿基緊挨

7、核糖核苷酸的3’端(+1)，CpRNaseHII酶促反應(yīng)速度受到更顯著影響。不同的錯(cuò)配堿基位于DNA-rN1-DNA/DNA底物相同位點(diǎn)時(shí)，CpRNaseHII酶促反應(yīng)速度不同，即錯(cuò)配堿基的類型與CpRNaseHII酶促反應(yīng)速度有密切關(guān)系。錯(cuò)配堿基對(duì)CpRNaseHII酶促反應(yīng)速度的影響可能是因?yàn)殄e(cuò)配堿基的存在能夠影響底物的構(gòu)型，不同的錯(cuò)配堿基造成底物不同的構(gòu)型變化，導(dǎo)致CpRNaseHII酶促反應(yīng)速度產(chǎn)生很大差異。 研究表明C

8、pRNaseHII酶切DNA-rN1-DNA/DNA嵌合底物的酶切效率不受核糖核苷酸類型的影響，且CpRNaseHII酶切核糖錯(cuò)配底物的酶促反應(yīng)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于配對(duì)底物。根據(jù)CpRNaseHII這一特點(diǎn)，建立一種新型的SNP分型檢測(cè)技術(shù)-CpRNaseHII酶切法，區(qū)分DNA-rN1-DNA/DNA的單堿基突變，力求達(dá)到簡(jiǎn)單檢測(cè)SNP的目的。 CpRNaseHII酶切法分型SNP技術(shù)是以5’端熒光基團(tuán)標(biāo)記，3’端淬滅基團(tuán)標(biāo)記的分子信

9、標(biāo)作為檢測(cè)探針，利用CpRNaseHII對(duì)檢測(cè)探針酶切效率的差異導(dǎo)致的熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)達(dá)到SNP分型檢測(cè)的目的。該分型方法的探針為中間嵌合一個(gè)核糖核苷酸的DNA-rN1-DNA分子信標(biāo)(cMB)。目標(biāo)單鏈DNA分子(ssDNA)與cMB分子雜交形成正確配對(duì)或錯(cuò)配的CpRNaseHII底物。如果cMBs與目標(biāo)單鏈DNA分子正確配對(duì)，CpRNaseHII切割配對(duì)底物，發(fā)出的熒光可以實(shí)時(shí)檢測(cè)。第一輪酶切之后，過(guò)量的cMB分子與從酶促反應(yīng)復(fù)合物

10、中釋放出來(lái)的目標(biāo)單鏈DNA分子雜交，起始第二輪酶促反應(yīng)，這樣更多的熒光信號(hào)被釋放出來(lái)。相反，如果cMBs與目標(biāo)單鏈DNA分子形成的底物含有堿基錯(cuò)配，錯(cuò)配底物幾乎不能或很少被酶切，目標(biāo)單鏈DNA片段不能被有效釋放出來(lái)，阻止CpRNaseHII對(duì)過(guò)量cMBs分子進(jìn)一步酶切和熒光信號(hào)的積聚。因此可以根據(jù)檢測(cè)的熒光信號(hào)強(qiáng)度對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)。 CpRNaseHII酶切法對(duì)所有錯(cuò)配均可有效區(qū)分識(shí)別，它可以檢測(cè)1680-nt之內(nèi)的ss

11、DNA，這些ssDNA片段的長(zhǎng)度對(duì)SNP的分型檢測(cè)沒(méi)有影響。CpRNaseHII酶切法檢測(cè)SNP時(shí)，目標(biāo)片段拷貝數(shù)不變的情況下，增大檢測(cè)探針的摩爾數(shù)，match/mismatch熒光信號(hào)比值增大，這能夠提高SNP分型檢測(cè)的有效性和準(zhǔn)確性。利用CpRNaseHII酶切法對(duì)人HLA基因上的9個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，并且利用DNA測(cè)序技術(shù)驗(yàn)證CpRNaseHII酶切法分型SNP的準(zhǔn)確性。由于cMBs設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，加上分型操作只是反應(yīng)底物的簡(jiǎn)單添