基因單核苷酸多態(tài)性與肺炎支原體肺炎易感性及嚴(yán)重性相關(guān)性研究.pdf

1、研究目的：
　　本研究中一方面從遺傳學(xué)角度研究基因多態(tài)性與支原體肺炎的相關(guān)性，為支原體感染的預(yù)防控制、早期診斷和治療提供多方位的論證;另一方面對(duì)山東地區(qū)支原體肺炎患兒肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)進(jìn)行肺炎支原體P1基因分型及基因測(cè)序，探討山東地區(qū)肺炎支原體流行亞型及其基因變異情況;同時(shí)收集不同型別肺炎支原體感染患兒的臨床資料，探討肺炎支原體亞型與疾病嚴(yán)重程度之間是否存在相關(guān)性。目前

2、對(duì)兒童支原體肺炎在病原學(xué)及解剖結(jié)構(gòu)方面報(bào)道較多，而B(niǎo)ALF中細(xì)胞因子變化的研究尚不多。通過(guò)對(duì)支原體肺炎患兒BALF中IL-6、IL-27水平的檢測(cè)，探究各種疾病狀態(tài)下IL-6與IL-27的水平變化情況，比較各組細(xì)胞因子水平有無(wú)差異性，評(píng)估IL-6與IL-27的水平與重癥支原體肺炎的發(fā)生是否具有相關(guān)性，能否反應(yīng)該疾病的嚴(yán)重程度，盡可能的發(fā)掘更多的重癥支原體肺炎識(shí)別方法，爭(zhēng)取能為重癥支原體肺炎早期發(fā)現(xiàn)、診斷及治療提供更多的論據(jù)。
　　

3、研究方法：
　　本研究主要分為三個(gè)部分，第一部分中，采用病例-對(duì)照研究方法，收集2014年10月至2016年6月間于山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院住院的415例支原體肺炎患者外周靜脈血標(biāo)本，其中重癥肺炎205例，非重癥肺炎210例，同時(shí)收集兒保門診健康查體300例健康兒童的外周血標(biāo)本，以415例支原體肺炎患者和300例健康兒童為研究對(duì)象，提取各研究對(duì)象的基因組DNA，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)及測(cè)序方法對(duì)ACErs4340、GSTM1(Ins/del

4、)、IL-6(rs1800795)、NOS3(rs1799983)及CYP1A1(rs2606345)進(jìn)行基因分型，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析各多態(tài)性位點(diǎn)與MPP嚴(yán)重程度的相關(guān)性，從宿主層面來(lái)分析某些特定人群對(duì)支原體感染有無(wú)易感性，及與肺炎嚴(yán)重程度有無(wú)相關(guān)性。
　　第二部分于山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院住院部收集2015-2016年肺炎患兒的肺泡灌洗液，對(duì)診斷為MPP的240例患兒肺泡灌洗液標(biāo)本進(jìn)行P1基因分型，并進(jìn)行基因測(cè)序，探討此期間山東

5、地區(qū)肺炎支原體流行亞型及其基因變異情況;同時(shí)收集該組患兒的臨床資料，分析肺炎支原體亞型與疾病嚴(yán)重程度之間的相互關(guān)系。數(shù)據(jù)用SPSS22.0軟件進(jìn)行分析，采用卡方檢驗(yàn)和方差分析的方法來(lái)分析臨床癥狀和人口統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)（年齡和性別）。
　　第三部分為了探討兒童肺炎支原體與肺泡灌洗液中細(xì)胞因子之間的相互關(guān)系，選擇臨床采集的無(wú)肺部病變的支氣管異物患兒與MPP患兒的肺泡灌洗液作為對(duì)照組與研究組，采用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)技術(shù)監(jiān)測(cè)MPP患兒B

6、ALF中IL-6、IL-27水平，收集各組支原體肺炎患兒是否混合感染，病情輕重及肺泡灌洗液中MP-DNA拷貝值等臨床及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。ELISA檢測(cè)結(jié)果采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，連續(xù)性正態(tài)分布的計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多組均數(shù)的兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)方法。
　　研究結(jié)果：
　　第一部分中，研究發(fā)現(xiàn)，ACErs4340、NOS3rs1799983、CYP1A1rs260634

7、5存在三種基因型，但I(xiàn)L-6rs1800795和GSTM1基因(Ins/del)只有野生型和雜合型。對(duì)照組各單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisin，SNP)基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。病例和對(duì)照組中，ACErs4340ID(42.67％vs54.22％，OR=1.81，95％CI:1.31-2.48,P＜0.001),IL-6rs1800795GC(1.33％

8、vs5.78％,OR=4.54,95％CI:1.56-13.23,P=0.003),NOS3rs1799983TT(3.20％vs8.82％，OR=6.53，95％CI:1.95-21.87，P＜0.001)和等位基因的分布ACErs4340I(OR=1.32,95％CI:1.06-1.65，P=0.014)/NOS3rs1799983T(OR=1.48,95％CI:1.07-2.05,P=0.018)/IL-6rs1800795C(O

9、R=4.44,95％CI:1.53-12.86，P=0.0027)比較有統(tǒng)計(jì)意義，表明ACErs4340ID、IL-6rs1800795GC和NOS3rs1799983TT與MPP的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。而對(duì)于GSTM1(Ins/del)和CYP1A1rs2606345G/T，病例組和對(duì)照組比較基因型分布無(wú)明顯差異，Logistic回歸也未發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與MPP易感性相關(guān)。
　　繼續(xù)分析ACErs4340、GSTM1基因(Ins/de

10、l)、IL-6rs1800795、NOS3rs1799983和CYP1A1rs2606345各基因-基因之間的相互作用。等位基因頻率組合表示，ACErs4340D/NOS3rs1799983T/CYP1A1rs2606345G(OR=3.08,95％CI:1.80-5.26);ACErs4340D/NOS3rs1799983T(OR=3.44,95％CI:2.01-5.89)基因攜帶者，MPP患病風(fēng)險(xiǎn)明顯高于對(duì)照組。應(yīng)用MDR分析軟件繼

11、續(xù)探討這一群體中研究基因的SNP-SNP的交互作用。最終，ACErs4340及NOS3rs1799983被認(rèn)定為與MPP發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)最大(CV consisitency=9/10)。同時(shí)使用SAS軟件(version9.1.3portable)分析各SNP組合后的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果表明ACErs4340和NOS3rs11799983遺傳多態(tài)性的組合頻率在MPP病人(n=415)病例和對(duì)照組之間存在顯著差異(OR=3.32,95％CI:1.90-

12、5.85)。
　　此外，在415例MPP患者中，我們分析了各多態(tài)位點(diǎn)與MPP病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)，ACErs4340I等位基因攜帶者，嚴(yán)重MMP發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)要高1.44倍(OR=1.44,95％CI:1.05-1.97，P=0.024),IL-6rs1800795C等位基因攜帶者，發(fā)生嚴(yán)重MMP的風(fēng)險(xiǎn)要高6.9倍(OR=6.9，95％CI:2.14-22.22，P=0.001)。綜上所述，本研究提示SNP在MPP高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體篩查中

13、的潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　第二部分通過(guò)巢式多重PCR方法對(duì)240例MPP患兒肺炎支原體P1分型檢出P1-Ⅰ型228例，P1-Ⅱ型12例。研究表明，在研究期間，山東地區(qū)發(fā)生的MP感染以P1-Ⅰ型為主，未發(fā)現(xiàn)變異株。這一結(jié)果與歐洲某些國(guó)家，以及中國(guó)北京、浙江、天津等地區(qū)學(xué)者監(jiān)測(cè)結(jié)果相同。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)P1-Ⅱ型中重癥比例高于P1-Ⅰ型，肺炎支原體P1亞型與肺部感染嚴(yán)重程度可能存在相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.018＜0.05）。

14、>　　第三部分本研究BALF中的IL-6水平可反映MPP患者肺部感染程度，IL-6水平越高，肺部感染程度越重，高水平的IL-6與重癥MPP的發(fā)生具有相關(guān)性，未發(fā)現(xiàn)IL-27水平與重癥MPP的發(fā)生具有相關(guān)性;進(jìn)一步分組分析，單純支原體感染與混合支原體感染，都存在IL-6水平升高，混合感染相對(duì)于單純感染，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而IL-27在混合感染組降低明顯，與單純組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與對(duì)照組比較有顯著差異;肺泡灌洗液的MP-DNA拷貝值，其高

15、低與IL-6分泌水平存在相關(guān)性，而與IL-27無(wú)相關(guān)性。
　　研究結(jié)論：
　　1.ACErs4340，IL-6rs1800795和NOS3rs1799983的多態(tài)性與MPP易感性存在統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián);
　　2.交互分析證明，兒童ACErs4340D/NOS3rs1799983T基因攜帶者，MPP患病風(fēng)險(xiǎn)明顯增高;
　　3.ACErs4340I及IL-6rs1800795C等位基因攜帶者，發(fā)生重癥MMP的風(fēng)險(xiǎn)要高;