腺病毒介導(dǎo)的CNTF基因在大鼠脊髓表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(Ciliary Neurotrophic Factor,CNTF)是一種可以促進(jìn)多種神經(jīng)元分化和存活,阻止神經(jīng)元退變并保護(hù)神經(jīng)元免受損傷的神經(jīng)活性蛋白,1984年由Barbin等從雞胚睫狀體、脈絡(luò)膜、虹膜中提取獲得,因其能維持副交感神經(jīng)節(jié)的存活并對睫狀節(jié)神經(jīng)元具有營養(yǎng)作用而得名。CNTF最突出的作用是維持中樞和周圍運(yùn)動神經(jīng)元的生物活性,可以促進(jìn)多種神經(jīng)元的存活和分化,抑制神經(jīng)元受損后的退變。正常大鼠的脊髓可以表達(dá)

2、少量的CNTF,且損傷后在中樞及周圍神經(jīng)損傷局部會發(fā)生暫時(shí)性的表達(dá)上調(diào),但其難以達(dá)到對抗神經(jīng)損傷的水平。隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的快速發(fā)展,利用復(fù)制缺陷型重組腺病毒(Adcnovirus,AdV)將編碼神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因?qū)氲桨屑?xì)胞和組織中,以期得到穩(wěn)定持久的表達(dá)已成為神經(jīng)損傷修復(fù)領(lǐng)域新的研究方向。本實(shí)驗(yàn)將攜帶有CNTF的復(fù)制缺陷型腺病毒(AdCNTF)和不攜帶任何外源基因的復(fù)制缺陷型腺病毒(AdO)分別導(dǎo)入大鼠脊髓腰膨大中,觀察腺

3、病毒介導(dǎo)的外源性CNTF基因在大鼠脊髓的表達(dá)水平,以探討這一基因治療新途徑。
　　 方法:將7周齡、體重200-250g的健康Wistar大鼠126只隨機(jī)分至三組當(dāng)中。其中正常對照組(A組)42只,正常飼養(yǎng)不予處理;實(shí)驗(yàn)對照組(B組)42只,導(dǎo)入不攜帶外源基因的重組腺病毒載體AdO;實(shí)驗(yàn)組(C組)42只導(dǎo)入攜帶外源性CNTF基因的重組腺病毒載體AdCNTF。腹腔注射10％水合氯醛麻醉,麻醉成功后將大鼠固定于立體定位儀上,切取長約

4、2cm后正中縱切口,逐層切開并分離椎旁肌肉顯露T13椎板及棘突,仔細(xì)咬除T13椎板后明膠海綿輕微壓迫止血。微量注射器迅速吸取1μL病毒液,于T13脊髓后正中動脈稍偏右0.8mm處,斜向頭端45°刺入,進(jìn)針長度約2.5mm,緩慢推送1μL/min。實(shí)驗(yàn)對照組(B組)注入AdO,實(shí)驗(yàn)組(C組)注入AdCNTF,完畢滯針2min后緩慢拔針。充分止血,生理鹽水沖洗后局部應(yīng)用抗生素,關(guān)閉傷口。三組大鼠在B、C組注射腺病毒后2天、7天、2周、4周、

5、6周、8周、10周時(shí)取材。將同一時(shí)間點(diǎn)不同組別的wistar大鼠(6只)其中3只經(jīng)多聚甲醛灌注后取出脊髓腰膨大節(jié)段。另外3只大鼠在麻醉后不進(jìn)行灌注直接取出脊髓腰膨大節(jié)段,凍存于-70℃冰箱中留備RT-PCR實(shí)驗(yàn)之用。分別對三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的脊髓灌注標(biāo)本進(jìn)行40μm連續(xù)振動切片,進(jìn)行CNTF免疫組化實(shí)驗(yàn),計(jì)數(shù)脊髓前角CNTF陽性細(xì)胞數(shù)目。對凍存標(biāo)本進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn),逆轉(zhuǎn)錄脊髓組織中的CNTFmRNA,并以β-actin為內(nèi)參照,計(jì)算

6、CNTFmRNA的相對表達(dá)量。所測數(shù)據(jù)使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,以x-±s表示,首先對三組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),若方差齊同則應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行同一時(shí)間點(diǎn)組間兩兩比較,方差不齊采用Kruskal-Wills H檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1 CNTF基因在大鼠脊髓中的表達(dá)趨勢
　　 脊髓切片CNTF免疫組化檢測顯示A組(正常對照組)組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較均無顯著差

7、異(P＞0.05),認(rèn)為A組CNTF表達(dá)量不具有隨時(shí)間變化的趨勢;B組(實(shí)驗(yàn)對照組)手術(shù)導(dǎo)入脊髓空白腺病毒AdO后第2天CNTF表達(dá)量增加,第7天達(dá)高峰,2周時(shí)CNTF降至正常水平,在第2周及以后時(shí)間點(diǎn)與A組(正常對照組)比較無顯著差異(P＞0.05);C組(實(shí)驗(yàn)組)在手術(shù)導(dǎo)入脊髓攜帶有CNTF基因的AdCNTF后第2天CNTF表達(dá)量增加,表達(dá)高峰同為第7天,此后逐漸下降,至第8周時(shí)降至正常水平,且C組的CNTF表達(dá)量在第2天、7天、2

8、周、4周、6周時(shí)均高于同時(shí)間點(diǎn)B組和A組。統(tǒng)計(jì)分析顯示:在手術(shù)導(dǎo)入腺病毒后第2天、7天,三組兩兩比較均有顯著差異(P＜0.05);在第2周、4周、6周,B、C組與A組(正常對照組)比較,C組與其有顯著差異(p＜0.05);在第8周、10周,三組兩兩比較均無顯著差異(p＞0.05)。
　　 2 脊髓標(biāo)本腺病毒PCR檢測
　　 利用腺病毒特異性引物對腺病毒10×梯度稀釋液中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,測出AdCNTF與AdO具有共同的

9、最低稀釋度104。在不同時(shí)間點(diǎn)對B組(實(shí)驗(yàn)對照組)和C組(實(shí)驗(yàn)組)脊髓標(biāo)本中腺病毒DNA進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)腺病毒DNA含量隨時(shí)間下降,導(dǎo)入后第10周已測不到腺病毒DNA。
　　 3 CNTF mRNA表達(dá)趨勢
　　 用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(RT-PCR)檢測CNTF mRNA在正常對照組(A組)、實(shí)驗(yàn)對照組(B組)、實(shí)驗(yàn)組(C組)中的變化趨勢:正常對照組(A組)存在低水平的CNTF mRNA表達(dá),表達(dá)量不隨時(shí)間變化;實(shí)驗(yàn)對照組(

10、B組)在手術(shù)導(dǎo)入無外源基因的腺病毒AdO2天后,與同時(shí)間點(diǎn)正常對照組(A組)比較CNTF mRNA表達(dá)量增多,第7天達(dá)到高峰,2周時(shí)降至正常水平;實(shí)驗(yàn)組(C組)手術(shù)導(dǎo)入攜帶有CNTF基因的腺病毒.AdCNTF后2天可檢測到CNTF mRNA升高,表達(dá)高峰同為第7天,此后呈下降趨勢,至第8周時(shí)降至正常水平。在第2天、7天、2周、4周、6周時(shí)C組CNTF mRNA表達(dá)量均高于同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)對照組(B組)和正常對照組(A組)。統(tǒng)計(jì)分析顯示:手術(shù)

11、導(dǎo)入病毒后第2天、7天時(shí)三組兩兩比較均有顯著差異(P＜0.05),第2周、4周、6周時(shí)另兩組與A組(正常對照組)比較,C組與其有顯著差異(p＜0.05),8周、10周時(shí)三組兩兩比較均無顯著差異(p＞0.05)。
　　 結(jié)論:正常大鼠脊髓組織中即存在低水平的內(nèi)源性CNTF表達(dá)。大鼠脊髓在導(dǎo)入不攜帶外源基因的腺病毒AdO后,內(nèi)源性CNTF表達(dá)水平較正常大鼠短暫增高,這是由于腺病毒引起的炎性刺激、免疫反應(yīng)及手術(shù)造模過程對脊髓造成了損傷