海蜇毒素磷脂酶A2和穿孔蛋白基因的克隆與表達(dá).pdf

1、海蜇（Rhopilema esculentum）隸屬于刺胞動(dòng)物門、缽水母綱、根口水母目、海蜇屬，作為一種大型的可食用經(jīng)濟(jì)水母，在我國(guó)海洋漁業(yè)中占有重要地位。其基礎(chǔ)生物學(xué)研究深入，人工繁育、增養(yǎng)殖技術(shù)成熟，是研究水母發(fā)育過程基因表達(dá)調(diào)控及水母毒素組成、結(jié)構(gòu)和功能的理想模式生物。
　　本研究在454轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，通過EST序列分析、cDNA末端快速擴(kuò)增（RAC E）技術(shù)從刺胞動(dòng)物門的海蜇中克隆獲得兩個(gè)磷脂酶 A2基因cDNA全長(zhǎng)

2、序列（命名為RePLA2-1、RePLA2-2）、兩個(gè)穿孔蛋白基因cDNA全長(zhǎng)序列（命名為 RePFP-1、RePFP-2），并對(duì)這些基因進(jìn)行了原核表達(dá)及重組蛋白功能分析。詳細(xì)結(jié)果信息如下：
　　1、RePLA2-1基因cDNA全長(zhǎng)為824bp，開放閱讀框（ORF）504bp，能夠編碼167個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)RePLA2-1的分子式為C833H1283N235O241S15，推測(cè)的半衰期為30h，不穩(wěn)定指數(shù)為61.93，屬于不穩(wěn)定蛋白

3、。親水性平均數(shù)（GRAVY)為-0.124，推測(cè)該蛋白為水溶性蛋白。根據(jù)氨基酸序列預(yù)測(cè)的分子量和等電點(diǎn)分別是18.93KDa和8.02。RePLA2-2基因cDNA序列全長(zhǎng)840bp，預(yù)測(cè)的開放閱讀框（ORF）包含495個(gè)核苷酸，編碼165個(gè)氨基酸序列。N-端前23個(gè)核苷酸為信號(hào)肽，5’非編碼區(qū)(UTR)和3’非編碼區(qū) UTR分別包含6個(gè)核苷酸和336核苷酸。預(yù)測(cè)RePLA2-2的分子式為C844H1278N228O232S13，分子量

4、和等電點(diǎn)分別是18.747KDa和8.94。推測(cè)的半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為32.64，屬于穩(wěn)定蛋白。親水性平均數(shù)（GRAVY)為-0.276，推測(cè)該蛋白為水溶性蛋白。利用overlap PCR技術(shù)，獲得了RePLA2-1、RePLA2-2基因組全長(zhǎng)序列。RePLA2-1基因組序列全長(zhǎng)2937bp，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。ReP LA2-2基因組序列全長(zhǎng)2113bp，由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成。Blast比對(duì)結(jié)果顯示，RePLA

5、2-1、RePLA2-2屬于Phospholip_A2_3家族。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，RePLA2-1、RePLA2-2與僧袍芋螺、星狀?？?、長(zhǎng)牡蠣毒素PLA2聚為GIX PLA2一支，與GXIII、GXII PLA2家族成員共聚為pfam-collection。熒光定量PCR顯示，蜇RePLA2-1、RePLA2-2基因在海蜇不同發(fā)育階段均有表達(dá)。其中，RePLA2-1在海蜇水螅體發(fā)育階段及橫裂體發(fā)育階段具有較高表達(dá)量。在橫裂體發(fā)育階段R

6、ePLA2-1 mRNA達(dá)到四個(gè)發(fā)育階段的最高值，為碟狀體階段的12.2倍；其次為水螅體體階段，為水碟狀體階段的7.6倍；水母體階段也達(dá)到了碟狀體階段的5.5倍。RePLA2-2在海蜇水母體、碟狀體發(fā)育階段具有較高表達(dá)，分別為橫裂體階段的10.8倍和4.4倍。在水螅體階段表達(dá)量為橫裂體階段表達(dá)量的1.3倍，無明顯差異。以海蜇cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增RePLA2成熟肽部分，進(jìn)行原核表達(dá)。重組蛋白以包涵體的形式表達(dá)，經(jīng)純化、透析復(fù)

7、性后獲得的重組蛋白能夠水解大豆卵磷脂。
　　2、獲得的海蜇RePFP-1 cDNA全長(zhǎng)2303bp，包含1883bp的開放閱讀框，能夠編碼610個(gè)氨基酸，3’UTR包括一個(gè)多腺苷酸Poly(A)尾和一個(gè)多腺苷酸化加尾信號(hào)AATAAA。RePFP-1基因組全長(zhǎng)5786bp，由7個(gè)外顯子6個(gè)內(nèi)含子組成，所有內(nèi)含子外顯子的剪切位點(diǎn)均符合 GT-AG剪切規(guī)則。RePFP-2 cDNA全長(zhǎng)2212bp，包含1842bp的開放閱讀框，編碼61

8、3個(gè)氨基酸，3’UTR包括一個(gè)多腺苷酸Poly(A)尾和一個(gè)多腺苷酸化加尾信號(hào)AATAAA。RePFP-2基因組全長(zhǎng)8609 bp，由8個(gè)外顯子7個(gè)內(nèi)含子組成，所有內(nèi)含子外顯子的剪切位點(diǎn)均符合 GT-AG剪切規(guī)則。RePFP-1和RePFP-2之間氨基酸序列相似率為65％，都含有N端MACPF結(jié)構(gòu)域，與其他穿孔蛋白不同的是RePFP-1和RePFP-2蛋白C端均含有一個(gè)卵黃膜外層蛋白I結(jié)構(gòu)域（VMO I）。將RePFP-1和RePFP-

9、2與穿孔素、補(bǔ)體等含MACPF結(jié)構(gòu)域穿孔蛋白家族成員氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果表明RePFP-1和RePFP-2氨基酸序列與原生生物聚為一簇。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，我們對(duì)RePFP-1和RePFP-2 mRN A在海蜇水螅體、橫裂體、碟狀體和幼水母體四個(gè)典型發(fā)育階段進(jìn)行了相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)，結(jié)果表明，盡管RePFP-1和RePFP-2在海蜇四個(gè)發(fā)育階段都具有表達(dá)，但在早期發(fā)育水螅體階段有明顯的表達(dá)上調(diào)，而在幼水母體階段表達(dá)量較低。因

10、此，結(jié)合 VMOI在其他生物卵子發(fā)生過程中的作用我們推測(cè)RePFP-1和RePFP-2蛋白可能并不僅是作為毒素起作用，還可能參與海蜇早期發(fā)育的調(diào)控。在RePFP-1和RePFP-2 MACPF結(jié)構(gòu)域兩端分別設(shè)計(jì)引物，以海蜇cDNA為模板擴(kuò)增海蜇 PFP蛋白 MACPF結(jié)構(gòu)域部分，并構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pet28-RePFP-1和pet28-RePFP-2，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，并實(shí)現(xiàn)了重組表達(dá)。但是，重