溶栓抗凝雙功能融合蛋白的構(gòu)建表達(dá)和功能研究及PEG修飾的水蛭素緩釋劑型的研究.pdf

1、心腦血管系統(tǒng)疾病已經(jīng)成為威脅人類(lèi)健康的重要?dú)⑹?，其中急性心肌梗塞位于一些西方發(fā)達(dá)國(guó)家死亡疾病之首。血栓形成是該類(lèi)疾病的一個(gè)重要誘因，溶栓療法是其治療的最主要手段。在溶栓治療過(guò)程中，為防止溶栓后再栓塞的發(fā)生，溶栓和抗凝藥物聯(lián)合應(yīng)用是臨床治療血栓相關(guān)性疾病的重要給藥方案，而出血傾向是血栓治療的主要副作用。 水蛭素是凝血酶的特異性抑制劑，是一種新型的抗凝和抗栓藥物，但體內(nèi)半衰期較短。為延長(zhǎng)其半衰期，我們利用聚乙二醇對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾。通

2、過(guò)改變化學(xué)反應(yīng)中聚乙二醇與水蛭素的比例以及反應(yīng)體系的pH，獲得了不同修飾度的產(chǎn)物。質(zhì)譜法、SDS-PAGE和HPLC方法分析結(jié)果表明修飾產(chǎn)物是不同修飾度水蛭素的混合物。TH發(fā)色底物法分析了聚乙二醇修飾前、后水蛭素的活性，結(jié)果顯示當(dāng)聚乙二醇與水蛭素摩爾比超過(guò)3：1時(shí)，水蛭素被修飾后抗凝活性明顯下降。用凝膠過(guò)濾層析對(duì)水蛭素的聚乙二醇修飾產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化，得到了3個(gè)不同修飾度的產(chǎn)物。活性分析表明，連接1個(gè)或2個(gè)聚乙二醇分子的水蛭素保持了原有

3、活性，而連接3個(gè)以上聚乙二醇的水蛭素活性明顯降低。動(dòng)物血漿APTT測(cè)定結(jié)果表明連接1個(gè)和2個(gè)聚乙二醇分子的水蛭素可不同程度地延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期。因此，我們通過(guò)控制聚乙二醇對(duì)水蛭素的修飾反應(yīng)條件，得到了活性保持良好、半衰期延長(zhǎng)的聚乙二醇修飾的水蛭素產(chǎn)品，使其有可能成為一種新的抗凝藥物的緩釋劑。 組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)和葡激酶(SAK)對(duì)血栓都具有一定的選擇性，因而是目前被認(rèn)為溶栓效果較好、副作用較小的兩種溶栓藥物。為進(jìn)一步提

4、高t-PA和SAK對(duì)血栓的選擇性、提高溶栓效率、降低其臨床用藥量，同時(shí)，降低HV在非血栓部位的濃度或活性從而減小出血的危險(xiǎn)，我們利用HV的C-末端對(duì)凝血酶的高親和性和N-末端延伸引起活性降低的特性，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了三個(gè)融合蛋白：①通過(guò)凝血因子FXa識(shí)別序列連接的t-PA與HV的融合蛋白(TFXH)；②通過(guò)凝血因子FXa識(shí)別序列連接的SAK與HV的融合蛋白(SFXH)；③通過(guò)凝血酶識(shí)別序列連接的SAK與HV的融合蛋白(STH)。目的是期望融合

5、蛋白具有以下特性①溶栓抗凝雙重功能；②靶向釋放抗凝活性；③減小出血傾向等。 t-PA是血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一種絲氨酸蛋白酶，含有17對(duì)二硫鍵，而HV分子中有3對(duì)二硫鍵，考慮到翻譯后的正確折疊和加工修飾，我們采用酵母表達(dá)體系表達(dá)融合蛋白TFXH。通過(guò)提取ECV304細(xì)胞總RNA和RT-PCR的方法獲得了tpa基因，5'端含有FXa識(shí)別序列(IEGR)對(duì)應(yīng)堿基的HV基因(fxh)通過(guò)引物設(shè)計(jì)和PCR方法產(chǎn)生。tpa基因與fxh基因通過(guò)

6、連接酶連入pGEM-T，產(chǎn)生融合蛋白基因tfxh，然后經(jīng)載體pIC9最終克隆至表達(dá)載體pIC9K上。融合蛋白基因tfxh經(jīng)電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115。限制性酶切和PCR鑒定結(jié)果均表明融合蛋白基因tfxh已克隆入表達(dá)載體和宿主菌。通過(guò)甲醇利用實(shí)驗(yàn)、G418抗性篩選實(shí)驗(yàn)獲得了多拷貝甲醇迅速利用型克隆。轉(zhuǎn)化子用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，搖瓶?jī)?nèi)表達(dá)產(chǎn)物TFXH以單鏈和雙鏈兩種形式存在，而在發(fā)酵罐中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，

7、TFXH單鏈形式減少，主要以雙鏈形式存在。采用纖維蛋白平板溶圈法和纖維蛋白凝塊法分別檢測(cè)TFXH的溶栓和抗凝活性。結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物TFXH具有溶栓活性并可被抗t-PA抗體抑制，完整的TFXH無(wú)抗凝活性，但以FXa裂解后可釋放游離水蛭素從而表現(xiàn)出抗凝活性。采用親和層析的方法對(duì)TFXH進(jìn)行了分離純化，得到了較純的TFXH產(chǎn)品。 SAK是由某些金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的一種非酶類(lèi)蛋白，本身無(wú)酶活性，在與纖溶酶原1：1結(jié)合后能使纖溶酶原活化為

8、有活性的纖溶酶，進(jìn)而激活更多的纖溶酶原，從而產(chǎn)生溶栓作用。我們采用大腸桿菌表達(dá)體系來(lái)表達(dá)SAK和HV的融合蛋白SFXH和STH，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究了SFXH和STH的功能。 融合蛋白SFXH和STH的構(gòu)建、表達(dá)和分離純化工藝的建立：通過(guò)提取金黃色葡萄球菌基因組DNA和PCR的方法獲得sak基因，通過(guò)引物設(shè)計(jì)和PCR方法分別獲得5'端含有FXa識(shí)別序列(IEGR)對(duì)應(yīng)堿基和凝血酶識(shí)別序列(LGPR)對(duì)應(yīng)堿基的兩種HV基因：

9、fxh和th。兩種融合蛋白基因sfxh和sth克隆到表達(dá)載體pBV220，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后進(jìn)行溫度誘導(dǎo)表達(dá)，在發(fā)酵過(guò)程中考察了種子培養(yǎng)時(shí)間和流加營(yíng)養(yǎng)物對(duì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)和蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示種子放大培養(yǎng)12h為最佳，營(yíng)養(yǎng)物的流加可增加最終的菌體濕重和蛋白表達(dá)量。采用反復(fù)凍融提取、凝膠過(guò)濾層析和離子交換層析的方法對(duì)融合蛋白進(jìn)行分離純化，純化的蛋白回收率和活性回收率分別為20.6％和57.6％。純化產(chǎn)物經(jīng)HPLC和SDS-PAGE分析，其純度達(dá)

10、96％以上。SFXH的N-末端測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致，等電點(diǎn)為5.53，相對(duì)分子質(zhì)量為22998.60。 融合蛋白SFXH和STH的功能研究：在體外，SFXH和STH可分別被FXa和凝血酶裂解，均可分別產(chǎn)生游離的SAK和HV。采用纖維蛋白平板溶圈法和發(fā)色底物S-2251法檢測(cè)融合蛋白的纖溶活性，纖維蛋白凝塊法檢測(cè)抗凝活性。結(jié)果表明兩種融合蛋白SFXH和STH都具有溶栓活性但無(wú)抗凝活性，SFXH以FXa裂解后可釋放抗凝活性。免疫組化實(shí)

11、驗(yàn)結(jié)果提示SFXH和STH對(duì)血栓具有一定的靶向性，且能溶解血栓中的纖維蛋白。 SFXH和STH的體內(nèi)功能研究：我們通過(guò)角叉菜膠引發(fā)的小鼠尾部血栓和大鼠下腔靜脈血栓兩種不同機(jī)制的血栓模型對(duì)SFXH和STH的體內(nèi)溶栓抗凝作用進(jìn)行了評(píng)價(jià)：①小鼠尾部血栓模型：通過(guò)皮下給予角叉菜膠引發(fā)小鼠尾部血栓形成，然后給予各受試藥物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SFXH和STH組血栓發(fā)生頻率和血栓長(zhǎng)度都低于生理鹽水組和SAK組。②大鼠下腔靜脈血栓模型：通過(guò)結(jié)扎大鼠下

12、腔靜脈在下腔靜脈內(nèi)制造血栓，然后給予各受試藥物。給藥后1h取血栓稱(chēng)濕重，測(cè)定結(jié)扎前、給藥前、給藥后30min和給藥后1h血漿的TT、APTT和PT值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SFXH和STH組血栓濕重明顯低于SAK組和HV組，SFXH組效果與SAK+HV聯(lián)合用藥組相當(dāng)。SFXH和STH組血漿TT、APTT和PT無(wú)明顯升高，而HV組和SAK+HV組明顯升高。 通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以得出以下結(jié)論：①通過(guò)控制PEG對(duì)水蛭素的修飾反應(yīng)條件，得到

13、了活性保持良好、半衰期延長(zhǎng)的PEG修飾的水蛭素產(chǎn)品。②通過(guò)FXa識(shí)別序列連接的t-PA和HV融合基因tfxh成功構(gòu)建至畢赤酵母GS115中并獲得了表達(dá)；完整的融合蛋白TFXH在體外具有溶栓活性而無(wú)抗凝活性，被FXa裂解后具有抗凝活性，因而具有溶栓和抗凝雙功能；③通過(guò)FXa識(shí)別序列和凝血酶識(shí)別序列連接的SAK和HV融合基因sfxh和sth成功構(gòu)建至大腸桿菌中并獲得高效表達(dá)；建立了融合蛋白SFXH和STH的生產(chǎn)工藝，工藝簡(jiǎn)單可行，并可穩(wěn)定放