SLC-anti CEA ScFv雙功能抗體融合蛋白的構(gòu)建與表達.pdf

1、外周淋巴組織趨化性細胞因子(SLC)具有趨化T細胞和成熟樹突狀細胞及B淋巴細胞的能力,并可引發(fā)T細胞歸巢,具有確定的依賴T細胞的抗腫瘤作用.癌胚抗原CEA(carcinoembryonic antigen)是一種廣譜腫瘤標志物,在惡性腫瘤的鑒別診斷,病情監(jiān)測等方面有著重要的臨床價值,是腫瘤治療理想的靶抗原,抗CEA抗體作為導向藥物載體,攜帶具有細胞殺傷活性的同位素、化療制劑、毒素、藥物前體,進行腫瘤導向治療有著廣泛的應用前景.細胞因子-

2、抗體融合蛋白可以在體內(nèi)有效的將細胞因子定位到表達腫瘤相關(guān)抗原的腫瘤細胞處,在腫瘤的治療中已成為一種有效的靶向性策略,此融合蛋白將腫瘤抗體分子的特異性與細胞因子的多能性很好的保留了下來.該實驗室利用基因工程技術(shù)將編碼SLC和抗CEA單鏈抗體的核苷酸序列克隆至經(jīng)改變多克隆位點序列而適合表達雙特異抗體的載體pALM中,成功構(gòu)建了雙功能抗體融合蛋白分子.該研究在此基礎(chǔ)上,在重組表達載體pALMSLC-anti CEA ScFv上,PCR擴增出雙

3、功能分子SLC-anti CEA ScFv的編碼序列,經(jīng)酶切處理后,分別克隆至同樣經(jīng)酶切處理的載體pTMF和pTFRSM中,PCR和測序鑒定結(jié)果表明,成功構(gòu)建了重組表達載體pTMF SLC-anti CEA ScFv和pTFRSM SLC-anti CEA ScFv.SDS-PAGE和Western blotting分析結(jié)果表明目的蛋白SLC-anti CEA ScFv在各載體中均獲得特異表達,分別從不同的誘導表達時間、溫度等方面摸索了

4、SLC-anti CEAScFv在不同載體中的表達條件,結(jié)果顯示,該融合蛋白SLC-anti CEA ScFv在P<'ALM>中的表達量最高,主要以包涵體的形式存在,而在載體P<'TFRSM>中的表達產(chǎn)物主要以可溶形式存在,證明了分子伴侶FkpA可以顯著提高目的蛋白的可溶性表達.表達產(chǎn)物采用鎳離子螯合層析法進行了純化,純化率達到了95%.在獲得了純化的SLC-anti CEA ScFv的樣品后,首先采用ELISA法對其抗原結(jié)合活性進行了

5、測定,以OD490比陰性對照高出2.5倍為活性合格的標準.結(jié)果顯示,SLC-anti CEA ScFv與T細胞Jurkat細胞和結(jié)腸癌細胞SW116均有較高的結(jié)合活性.說明它具有較好的靶向性和特異性.在此基礎(chǔ)上,對活性合格樣品進行了趨化活性的研究,結(jié)果也比較理想,在以外周血淋巴細胞為計數(shù)細胞時,該融合蛋白表現(xiàn)出明顯的趨化作用,其濃度為0.225 ug/ml-1.65ug/ml時對淋巴細胞的趨化指數(shù)最高.趨化實驗和ELISA實驗結(jié)果顯示我