megsin對(duì)糖尿病小鼠腎組織P27表達(dá)的影響.pdf

1、目的：隨著人們生活水平的提高和人口的老齡化，糖尿病（diabetes mellitus，DM）的發(fā)病率逐年升高，糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy， DN）也逐年增加，DN已成為導(dǎo)致終末期腎衰竭腎臟替代治療的最常見(jiàn)原因。因此，在細(xì)胞分子水平以及基因水平探索DN的發(fā)病機(jī)制十分重要。
　　 系膜細(xì)胞在維持腎小球的結(jié)構(gòu)和功能方面起著重要的作用，并且參與了多種腎小球疾病的致病過(guò)程。糖尿病腎病的病理基礎(chǔ)為系膜細(xì)胞肥大和系

2、膜細(xì)胞外基質(zhì)積聚，是引起腎臟肥大、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）增多并進(jìn)一步導(dǎo)致腎小球硬化的重要原因。
　　 Megsin基因是從人類系膜細(xì)胞中分離出的一種新型基因，它在人、大鼠、小鼠系膜細(xì)胞中呈優(yōu)勢(shì)表達(dá)，主要在人類腎臟系膜細(xì)胞中表達(dá)，屬于絲氨酸蛋白酶超家族（serpin）的一員。文獻(xiàn)報(bào)告人類IgA腎病和糖尿病腎病及大鼠抗Thy-1腎炎的病變均表現(xiàn)為系膜細(xì)胞增殖和或系膜基質(zhì)擴(kuò)增，其致病機(jī)理和病變程度與megsin的表達(dá)水平是相關(guān)的，表明m

3、egsin表達(dá)可能通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和細(xì)胞生命周期參與腎小球硬化的過(guò)程。
　　 糖尿病時(shí)腎組織細(xì)胞周期異常不僅啟動(dòng)糖尿病腎?。―N）的發(fā)生而且也參與疾病進(jìn)展。
　　 p27kip1基因是一個(gè)調(diào)控細(xì)胞周期并抑制細(xì)胞分裂的重要基因，主要與細(xì)胞周期素（cyclin）結(jié)合而發(fā)揮對(duì)細(xì)胞周期素-細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶（cyclin-cyclin depedent kinase，CDKs）的抑制作用。p27kip1是近年來(lái)研究較

4、多的細(xì)胞周期抑制劑（cyclin depedent kinase inhibitor，CKI-s），可抑制幾乎所有的cyclin-CDK復(fù)合物的激酶活性，對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用。研究表明，p27kip1對(duì)于腎小球疾病中系膜細(xì)胞的肥大及腎臟肥大起著重要作用，其主要功能是作為CDK抑制因子參與細(xì)胞周期調(diào)控；正常情況下，p27kip1在G0/G1期表達(dá)增高，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入S期時(shí)表達(dá)下降，若某種因素刺激導(dǎo)致p27在系膜細(xì)胞中表達(dá)增高，則可使細(xì)胞周期

5、停滯于G1期，導(dǎo)致細(xì)胞肥大。研究證明腎小球系膜細(xì)胞受不同因素作用后P27表達(dá)水平不同，說(shuō)明P27在調(diào)節(jié)系膜細(xì)胞增值過(guò)程中起重要作用。P27在正常的靜止期系膜細(xì)胞中呈結(jié)構(gòu)性表達(dá)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中系膜細(xì)胞增殖也與p27蛋白表達(dá)水平密切相關(guān)，而且鑒于P27在調(diào)節(jié)系膜細(xì)胞增殖中的重要作用，許多研究亦將其作為抑制系膜細(xì)胞增殖的作用靶點(diǎn)，且通過(guò)某些直接或間接干預(yù)措施，上調(diào)或抑制P27蛋白的表達(dá)水平，從而達(dá)到抑制系膜細(xì)胞增殖或肥大的作用。
　　 本

6、課題擬通過(guò)鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)建立糖尿病小鼠模型，并通過(guò)尾靜脈質(zhì)粒注射法，將megsin質(zhì)粒、megsin-siRNA質(zhì)粒及空質(zhì)粒經(jīng)由尾靜脈注入糖尿病小鼠體內(nèi)，以此分成三組，采用單側(cè)腎切除組為正常對(duì)照組，觀察不同組腎臟病變的程度，并采用免疫組化方法檢測(cè)不同組megsin、Ⅳ型膠原、P27的表達(dá)水平，采用蛋白印記（western-blot）半定量檢測(cè)腎小球裂解液P27的蛋白表達(dá)水平，從而探討megsin參

7、與調(diào)節(jié)腎小球系膜細(xì)胞增殖乃至細(xì)胞周期調(diào)控的機(jī)制，為闡明DN的發(fā)病機(jī)制及尋找先進(jìn)的治療方法提供實(shí)驗(yàn)性理論依據(jù)。
　　 方法：選擇清潔級(jí)健康雄性CD-1小鼠60只，體重（20～30g）克，首先行單側(cè)腎切除，后隨機(jī)分為4組，每組15只，隨機(jī)抽取3組腹腔注射STZ（溶于0.1mol/L檸檬酸緩沖液，濃度為2％，pH值為4.5，注射劑量為60mg/kg）制備糖尿病小鼠模型，剩余15只做為正常對(duì)照組（A組）。48小時(shí)后測(cè)定血糖、尿糖，血糖≥

8、16.7mmol/L且尿糖+++～++++確定為糖尿病小鼠模型。然后采用尾靜脈質(zhì)粒注射法，將megsin質(zhì)粒、megsin-siRNA質(zhì)粒及空質(zhì)粒經(jīng)由小鼠尾靜脈注分別注入3組小鼠體內(nèi)（15ug/kg，1次/周），連續(xù)12周。以此分為空質(zhì)粒注入組-糖尿病對(duì)照組（B組），megsin質(zhì)粒組（C組）及megsin-siRNA組（D組）。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲食，不使用胰島素及其它降糖藥物。分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后1、2、12周各組任取5只小鼠測(cè)定腎重/體

9、重、血肌酐（Scr）、24小時(shí)尿蛋白定量，然后處死，留取腎組織標(biāo)本行HE染色，免疫組化染色檢測(cè)腎組織megsin、Ⅳ型膠原、P27表達(dá)情況，蛋白印記法檢測(cè)腎小球裂解液P27的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.一般情況
　　 B組、C組、D組大鼠注射STZ后4～5天即出現(xiàn)多飲、多食、多尿，逐漸消瘦，三組并無(wú)明顯差異，而A組則無(wú)上述情況出現(xiàn)。
　　 2.12周末KW/

10、BW、24小時(shí)尿蛋白定量（UP）、血肌酐（Scr）升高，差異有顯著性意義（P<0.01）；C組和B組相比，12周末UP、Scr和KW/BW比值升高更為明顯，差異有顯著性意義（P<0.01）。B組和同期A組相比，BG一直明顯升高，C組和B組相比，差異無(wú)顯著性（P>0.01）。
　　 3.病理組織學(xué)改變：光鏡下觀察，A組在第一周時(shí)腎小球結(jié)構(gòu)基本正常，在第2周以及12周時(shí)腎小球體積變大；B組、C組、D組腎小球體積增大，系膜細(xì)胞增生，細(xì)

11、胞外基質(zhì)增多。B組、C組系膜細(xì)胞數(shù)較同期A組、D組增多（P<0.01）。
　　 4.免疫組化結(jié)果：1周、2周、12周時(shí)B組、C組腎皮質(zhì)megsin及Ⅳ型膠原的陽(yáng)性表達(dá)均強(qiáng)于A組、D組（P<0.01），其中C組強(qiáng)于B組（P<0.01）；D組腎皮質(zhì)megsin及Ⅳ型膠原陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)于A組（P<0.01）。1周、2周時(shí)B組、C組腎皮質(zhì)P27的陽(yáng)性表達(dá)均強(qiáng)于A組、D組（P<0.01），其中C組強(qiáng)于B組（P<0.01）；D組腎皮質(zhì)P27陽(yáng)性

12、表達(dá)強(qiáng)于A組（P<0.01）；第12周時(shí)C組P27表達(dá)仍強(qiáng)于各組（P<0.01），而B(niǎo)組和D組無(wú)明顯差異（P>0.01）。
　　 5.蛋白印跡法檢測(cè)腎小球P27：1周、2周時(shí)B組、C組腎皮質(zhì)P27的陽(yáng)性強(qiáng)度均強(qiáng)于A組、D組（P<0.01），其中C組強(qiáng)于B組（P<0.01）；D組強(qiáng)于A組（P<0.01）；第12周時(shí)C組P27表達(dá)強(qiáng)度仍高于各組（P<0.01），而B(niǎo)組和D組無(wú)明顯差異（P>0.01）。
　　 結(jié)論：
　

13、　 1.megsin在糖尿病小鼠腎組織中表達(dá)增強(qiáng)，與腎臟系膜細(xì)胞增殖、腎臟肥大及腎功能受損程度相一致，提示megsin在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起一定作用。
　　 2.過(guò)表達(dá)megsin糖尿病小鼠腎組織中P27表達(dá)明顯增強(qiáng)，較單純糖尿病小鼠腎臟系膜細(xì)胞增生、腎小球肥大，及腎功能受損程度明顯加重，提示megsin通過(guò)上調(diào)P27表達(dá)促進(jìn)腎小球肥大，可能是其參與糖尿病腎病病變過(guò)程的機(jī)制之一。
　　 3.通過(guò)megsin siR