莪蓮柴胡湯對(duì)裸鼠人肝細(xì)胞肝癌模型的抗癌作用研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(primary hepatic cailcer，PHC)，簡(jiǎn)稱肝癌，系原發(fā)于肝細(xì)胞和/或肝內(nèi)膽管細(xì)胞的惡性腫瘤，包括肝細(xì)胞癌、肝管細(xì)胞癌和混合癌。具有發(fā)現(xiàn)晚、發(fā)展快、治療難、預(yù)后差的特點(diǎn)，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，是嚴(yán)重危害人類健康的一種疾病。是世界上發(fā)病率最高的10種腫瘤之一，占全世界每年新發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的4﹪，我國(guó)肝癌病例數(shù)約占全世界肝癌總例數(shù)的43.7﹪。就死亡率而言，肝癌在全球男性惡性腫瘤中居第7位，女性中居第9位。我國(guó)肝

2、癌死亡率居惡性腫瘤死亡率的第2位，僅次于胃癌。由于肝癌的發(fā)病機(jī)制不明確，目前缺乏針對(duì)此病的特異性治療?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)采用外科手術(shù)、化療、放療、介入治療等綜合治療，其總體療效并不樂(lè)觀，其發(fā)病率及死亡率有逐步升高的趨勢(shì)。 中醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中，雖然無(wú)肝癌的病名，但相似的癥狀和體征記載十分豐富，多屬于中醫(yī)學(xué)“積聚”、“癥瘕”、“黃疸”、“臌脹”、“脅痛”等范疇。一般認(rèn)為，本病的發(fā)生是由于正氣不足，臟腑功能失調(diào)，氣滯、血瘀、痰凝、毒聚而形成的。肝癌的

3、病因病機(jī)總的來(lái)說(shuō)是本虛標(biāo)實(shí)，以脾虛為本，氣滯、血瘀、濕熱、毒邪為標(biāo)。 導(dǎo)師陳澤雄副教授依據(jù)中醫(yī)對(duì)肝癌“正虛邪實(shí)”、“本虛標(biāo)實(shí)”這一發(fā)病機(jī)制的根本認(rèn)識(shí)，認(rèn)為邪正關(guān)系始終是肝癌發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵，故“扶正祛邪”是治療肝癌的根本大法。莪蓮柴胡湯是導(dǎo)師對(duì)肝癌中醫(yī)臨床治療經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，具有健脾疏肝、解毒散結(jié)的功效。既往導(dǎo)師陳澤雄和師兄胡洪濤應(yīng)用本方的臨床和基礎(chǔ)研究證明其對(duì)中晚期肝癌或體外癌細(xì)胞具有一定的治療作用，可改善臨床癥狀，提高生活質(zhì)量，

4、抑制端粒酶活性等作用。因此，在活體中進(jìn)一步探討本方的抗癌作用機(jī)制，闡明其藥理活性意義重大。研究目的研究莪蓮柴胡湯對(duì)間接原位移植雄性裸鼠肝癌模型的抗癌作用。 1、探討運(yùn)用人類肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞株行間接“原位移植雄性裸鼠肝癌模型”的建立。 2、分析莪蓮柴胡湯對(duì)該模型解剖及生存情況的影響。 3、分析莪蓮柴胡湯對(duì)該模型肝組織、肝癌旁組織、肝癌組織PTEN蛋白陽(yáng)性表達(dá)的影響及其在3種組織中的表達(dá)強(qiáng)度。 材料 1

5、、造模材料人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株Bel-7402；BALB/c裸鼠，雄性，4～6周齡，60只。 2、干預(yù)材料莪蓮柴胡湯濃縮劑；FT207注射液(替加氟注射液)。 3、試劑兔抗人PTEN多克隆抗體、二步法免疫組化檢測(cè)試劑。 實(shí)驗(yàn)方法 1、造模采用Bel-7402人肝癌細(xì)胞株復(fù)制裸鼠“間接肝原位移植瘤模型”。 2、干預(yù)裸鼠在無(wú)特殊病原菌(SPF)條件下分籠飼養(yǎng)。將裸鼠隨機(jī)分為5組，造模裸鼠4組(中藥高、中、

6、低濃度組和FT-207化療組)，每組各12只，4組模型鼠術(shù)后即進(jìn)入實(shí)驗(yàn)?？诜o藥，0.2ml藥液/10g體重，每天一次，連續(xù)4周。第5組不造模，與0.2ml生理鹽水/10g體重灌服，作解剖對(duì)照。 3、處理觀察過(guò)程中，記錄瘤鼠的生存時(shí)間。治療結(jié)束，裸鼠眼球采血后處死解剖，記錄瘤體積、瘤指數(shù)(瘤重/體重)、肝指數(shù)(肝重/體重)、脾指數(shù)(脾重/體重)，并將正常肝組織、癌旁組織和癌組織標(biāo)本用4﹪中性甲醛溶液固定，送病理石蠟包埋切片。

7、 4、病理檢測(cè)組織學(xué)檢測(cè)，用常規(guī)蘇木精-伊紅染色(HE)；免疫組化檢測(cè)，采用二步法免疫組化檢測(cè)方法檢測(cè)PTEN蛋白表達(dá)；染色結(jié)果評(píng)估，采用Bresalier半定量公式判斷染色結(jié)果；讀片，雙人雙盲閱片，共2次，分別計(jì)算IS，取2次的平均數(shù)作為結(jié)果。 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：計(jì)量正態(tài)資料用“x±s”表示，非正態(tài)計(jì)量資料用“中位數(shù)(極值)”表示，計(jì)數(shù)資料用“部分/總體”，資料采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)量資料進(jìn)行T檢驗(yàn)、方差分析、秩

8、和檢驗(yàn)、計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)。 結(jié)果 1、解剖證實(shí)造模成功率48/48；實(shí)驗(yàn)結(jié)束獲得有效病理標(biāo)本48例。成瘤以單發(fā)巨塊型為主，部分伴肝內(nèi)和/或肺內(nèi)多發(fā)轉(zhuǎn)移，符合人類肝癌解剖特點(diǎn)。 2、牛存情況分析：治療組生存時(shí)間均長(zhǎng)于化療組，p<0.05或0.01。 3、體重變化分析：結(jié)果說(shuō)明中藥可能在保持瘤鼠體重，減輕腫瘤對(duì)機(jī)體的消耗、控制惡液質(zhì)的進(jìn)展比替加氟有效，p<0.05。 4、解剖情況分析：中

9、藥治療與替加氟治療比較不能減小瘤體積，p>0.05；但在抑制肝脾腫大上中藥治療優(yōu)于FT-207治療，p<0.05，且以高濃度組效果最好，p<0.01；治療組瘤鼠肝內(nèi)轉(zhuǎn)移少于對(duì)照組，p<0.05。 5、抑癌基因PTEN表達(dá)分析：結(jié)果說(shuō)明瘤鼠肝臟PTEN蛋白表達(dá)強(qiáng)度癌旁組織最高，癌組織最低，正常肝組織次之，p<0.05。中藥治療該肝癌動(dòng)物模型與替加氟對(duì)比，可以明顯提高抑癌基因PTEN的表達(dá)，p<0.05。 結(jié)論 1、

10、本研究所采用肝癌動(dòng)物模型是研究肝癌治療較為理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。 2、中高濃度(0.5g生藥/kg體重和1.0g生藥/kg體重)莪蓮柴胡湯可以延長(zhǎng)Bel-7402間接原位移植肝癌裸鼠模型的生存時(shí)間，提高生存率。 3、不同濃度莪蓮柴胡湯能夠控制該模型體重減輕，提高生存質(zhì)量；能夠減少該模型肝癌肝內(nèi)轉(zhuǎn)移率，減輕病情；能夠降低肝脾腫大增生；以中高濃度(0.5g生藥/kg體重和/或1.0g生藥/kg體重)為佳。 4、不同濃度