NOS抑制物ADMA對急性卒中預后的評估及神經保護的可能機制.pdf

1、非對稱性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)是內源性非選擇性一氧化氮合酶（nitric oxygen sythase，NOS）抑制劑，存在于人體內所有有核細胞中，可抑制體內一氧化氮(nitric oxygen，NO)的合成。ADMA可抑制內皮型NOS(endothelial NOS，eNOS)的活性，導致外周血管舒張功能受損，腦血流灌注下降，可能影響缺血性卒中患者的康復;然而，針對ADMA抑制

2、神經元型NOS(neuronal NOS，nNOS)及誘導型NOS(inducible NOS，iNOS)的活性，ADMA則抑制了由nNOS及iNOS介導的神經毒性作用，推測卒中后ADMA可能具有神經保護作用。那么，作為一個整體，ADMA通過影響不同NOS的作用，最終對卒中患者預后有何影響，從臨床到機制的研究尚無定論，尤其是卒中患者體內ADMA與卒中預后之間有無相關性，既往未見類似的研究。本研究通過臨床隊列與相應的細胞模型探索ADMA與

3、缺血性卒中的相關性以及可能的機制:1、建立超急性期缺血性卒中患者隊列，檢測其外周血ADMA濃度，并隨訪卒中后90 d的改良Rankin評分(modified Rankin Scale，mRS)，了解卒中后外周血ADMA濃度與卒中預后的相關性;2、通過體外培養(yǎng)大鼠神經元細胞，建立糖氧剝奪(oxygenglucose deprivation，OGD)模型模擬體內缺血性卒中過程，探討ADMA對OGD后神經元細胞的保護作用來間接了解缺血性卒中發(fā)

4、生后神經元細胞周圍的ADMA對神經元細胞的保護作用;3、通過大鼠神經元OGD模型初步探討ADMA對OGD后神經元細胞保護作用的機制。
　　第一部分急性缺血性卒中患者外周血ADMA水平與卒中預后相關性研究
　　目的了解缺血性卒中患者超急性期外周血ADMA水平的變化趨勢及其與卒中預后的相關性;了解缺血性卒中超急性期外周血ADMA濃度與炎癥水平的相關性。我們還分析了ADMA的同系物對稱性二甲基精氨酸(symmetricdimeth

5、ylarginine，SDMA)及精氨酸（arginine，Arg）與卒中預后的相關性。
　　方法本研究中共入組67例急性缺血性卒中患者及32例健康對照。所有病例均為發(fā)病6h以內的缺血性卒中患者，伴有頭顱CT或MRI等影像學上明確的與本次發(fā)病部位對應位置的缺血灶;排除標準包括:一過性腦缺血發(fā)作(transientischemic attack，TIA)、腦出血、惡性腫瘤、伴發(fā)嚴重感染性疾病、系統(tǒng)性風濕性疾病。健康對照組來源于卒中患

6、者的健康家屬。采集所有患者卒中起病后6h、12h、24 h、3d及7d的外周血標本。外周血ADMA、SDMA及Arg濃度采用高效液相色譜質譜串聯方法進行檢測。外周血炎癥指標單核細胞趨附因子-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、金屬基質蛋白酶-9(matrixmetalloproteinases，MMP-9)及組織型金屬機制蛋白酶抑制物-1(Tissue inhibitorof matr

7、ix metalloproteinase-1，TIMP-1)采用ELISA方法檢測。高敏CRP(highsensitive C-reactive protein，hsCRP)及白介素-6(interleukin-6，IL-6)通過比濁法進行檢測。預后評價指標為卒中后90 d的mRS評分，mRS0-1分為良好預后，mRS2-6分為不良預后。卒中后不同時間點ADMA、SDMA及Arg濃度的差別采用repeated measurement統(tǒng)計

8、方法進行統(tǒng)計。ADMA濃度與卒中預后相關性采用多元回歸分析方法。外周血ADMA濃度與炎癥指標之間的相關性采用Pearson或Spearman相關分析。
　　結果缺血性卒中超急性期各研究時間點外周血ADMA濃度均明顯高于健康對照組，p＜0.05;而SDMA及Arg濃度與健康對照組相比無明顯差異。急性卒中患者超急性期外周血ADMA及SDMA濃度均隨時間推移升高，ADMA在卒中后3d達高峰，此后開始下降;SDMA濃度則在卒中后24 h內

9、迅速上升，直至3d維持在較高水平。雖然卒中后外周血Arg濃度下降趨勢，但無統(tǒng)計學意義。血漿ADMA濃度變化時間曲線與卒中嚴重程度相關。中度及重度卒中外周血ADMA濃度在卒中后7d仍保持在較高水平，而輕度卒中外周血ADMA濃度3d達高峰，7d即可見明顯下降(p=0.048)。卒中后24 h SDMA濃度≥0.591 umol/L，卒中后3dADMA濃度≥0.566 umol/L及7 d ADMA濃度≥0.530 umol/L均提示缺血性卒

10、中患者卒中后90 d預后不良。卒中后24 h外周血SDMA濃度與MMP-9正相關，卒中后3d外周血ADMA濃度與IL-6及hsCRP等急性時相蛋白呈正相關，卒中后7 d ADMA濃度除了與IL-6及hsCRP呈正相關外，還與MCP-1及TIMP-1呈正相關。
　　結論缺血性卒中超急性期外周血ADMA及SDMA濃度可作為提示卒中預后的生物化學指標。卒中后外周血ADMA及SDMA的表達與炎癥水平相關。
　　第二部分 ADMA神經

11、保護作用的研究
　　目的研究ADMA對OGD缺氧復氧誘導神經元損傷的影響，探討ADMA對OGD后神經元細胞內NO水平的影響。
　　方法取體外培養(yǎng)7d的大鼠神經元細胞，隨機分成對照組、OGD組、不同濃度ADMA(3-300 uM)干預OGD組。根據實驗分組，對照組不給予任何干預措施;OGD組給予OGD干預1.5 h后復氧0-24 h;不同濃度ADMA干預OGD組為在OGD前24 h分別給予3 uM、10 uM、30 uM、10

12、0 uM及300 uM的ADMA預處理，并且在OGD及復氧2h過程中保持ADMA濃度不變。神經元損傷評價方法:1.神經元細胞免疫組化染色觀察神經元細胞形態(tài)學變化;2.測定細胞上清液中LDH含量評價神經元損傷程度。細胞內NO水平檢測采用NO檢測熒光探針DAF-FM DA，在熒光酶標儀上激發(fā)波長495 nm、發(fā)射波長515nm處檢測細胞內熒光探針的相對熒光單位(relative fluorescent unit，RFU)，計算細胞內NO的相

13、對含量。
　　結果與對照組相比，OGD缺氧復氧誘導神經元LDH釋放率為時間依賴性升高。OGD缺氧復氧后神經元形態(tài)發(fā)生變化:神經元胞體腫脹或皺縮，神經元軸突斷裂，部分可見軸突呈串珠樣改變，甚至軸突消失。ADMA干預OGD組神經元LDH釋放率顯著低于OGD組(p＜0.01)，但是下降程度無ADMA濃度依賴關系。神經元細胞免疫組化結果:與OGD組相比，30 uM ADMA干預OGD組神經元形態(tài)保持相對完整。與對照組相比，OGD組細胞內N

14、O水平升高(p＜0.05);30 uMADMA干預OGD組復氧0-24 h，多數觀察時間點神經元細胞內的NO水平與OGD組無顯著差異(p＞0.05)。
　　結論 ADMA可減少OGD缺氧復氧誘導的神經元損傷，起到神經保護作用，這種保護作用不依賴于ADMA對神經元NO水平的抑制作用。
　　第三部分 ADMA神經保護作用可能機制初步探討
　　目的研究縫隙連接蛋白-36（connexin36，cx36）在OGD缺氧復氧過程中

15、表達的變化，初步探討cx36在ADMA神經保護過程中的作用。
　　方法取體外培養(yǎng)7d的大鼠神經元細胞，隨機分成對照組、OGD組、及ADMA干預OGD組。對照組不給予任何特殊干預;OGD組給予OGD1.5 h后復氧0-24 h;ADMA干預OGD組為OGD處理前24 h給予30 uM ADMA干預，并在之后的實驗過程中保持該濃度不變。采用Western blot方法檢測不同處理組神經元細胞cx36的表達情況。采用熒光黃染料負荷實驗評

16、估各組神經元細胞的縫隙連接介導的細胞通訊（Gap junction intercellular communication，GJIC）功能。
　　結果 OGD缺氧復氧后0-24 h，神經元細胞cx36表達量逐漸增加，復氧4h、12 h及24 h cx36表達量顯著高于正常對照組(p＜0.05)。與單純OGD缺氧1.5 h復氧4h的神經元相比，經30 uM ADMA預處理的神經元在同樣的OGD條件下cx36的表達量下降(p＜0.05

17、)。熒光黃染料負荷實驗發(fā)現，對照組僅分布在劃痕兩側的神經元有熒光黃染料浸潤;OGD組除劃痕兩側鄰近細胞有熒光黃染料的浸潤外，稍遠離劃痕的神經元細胞亦有熒光黃染料浸潤;ADMA干預OGD組熒光黃染料浸潤情況與對照組相似。
　　結論 ADMA可下調OGD缺氧復氧誘導的cx36表達增加及GJIC功能增高，提示對cx36的調控是ADMA神經保護作用的其中一個可能機制。
　　結論
　　1.缺血性卒中后外周血ADMA濃度升高。癥狀

18、嚴重程度不同，ADMA濃度的時間變化趨勢亦不同。
　　2.缺血性卒中急性期外周血ADMA及SDMA濃度可提示卒中后90d預后，ADMA及SDMA濃度越高，卒中預后越差。
　　3.缺血性卒中急性期外周血ADMA及SDMA濃度與炎癥指標有相關性。
　　3.ADMA可減輕OGD缺氧復氧誘導的神經元細胞損傷，有神經保護作用。
　　4.ADMA可下調OGD后神經元cx36的表達，同時還可抑制OGD后GJIC功能，