ndrg2兩亞型重組腺病毒的構建及其抑制人腦膠質瘤細胞系生長的研究.pdf

1、膠質瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，具有高發(fā)病率，高致殘率和高死亡率，目前其臨床治療效果卻難以令人滿意。癌基因的激活和（或）抑癌基因的失活是膠質瘤的發(fā)生發(fā)展過程最基本的分子事件。因而基因治療在膠質瘤的治療極有前途。運用抑癌基因轉移到病人體內以增強人體抗瘤能力或促使瘤體消亡又是基因治療的首選。
　　人ndrg2基因是鄧艷春教授用消減雜交法從人腦組織中克隆得到的一個新基因，已登陸到基因庫（登錄號AF159092）。ndrg2是多種腫瘤組

2、織與相應正常組織的差異表達基因，在腦、骨骼肌和唾液腺中高表達;在肝、胃腸道上皮和肺上皮中中等表達；在胸腺、骨髓和睪丸中低表達。在神經(jīng)膠質瘤的組織標本和細胞系中，可發(fā)現(xiàn)ndrg2的表達降低。同時ndrg2在膠質瘤中過表達時，可抑制細胞增殖，同時細胞出現(xiàn)明顯的G1期阻滯ndrg2經(jīng)研究證實有ndrg2S和ndrg2L兩種亞型。ndrg2S全長為2024bp，編碼357個氨基酸；ndrg2L全長為2066bp，編碼371個氨基酸。既往我們的研

3、究多集中于ndrg2短基因（ndrg2S)上，而研究方法多采用免疫組化、RT-PCR和基因轉染。由于ndrg2的長基因和短基因的編碼區(qū)只相差42bp的核苷酸即14個氨基酸的序列，核苷酸序列的高度一致性和蛋白質抗原的相似性，使得在上述結果中不能區(qū)分開是ndrg2的長基因或短基因的作用，基因轉染實驗也只證明了ndrg2的短基因抗腫瘤作用，從來沒有人證明ndrg2長基因是否具有相同的抗腫瘤作用。
　　腺病毒是無包膜的線性雙鏈DNA病毒，

4、在自然界廣泛分布，對人致病性小，不誘導癌變，較為安全，不整合入細胞基因組，遺傳毒性低，宿主范圍廣，轉染效率高，易于制備，純化。腺病毒載體多用于基因表達，轉移和治療。轉基因效率高，容易制得高滴度病毒載體，全性高，進入細胞內并不整合到宿主細胞基因組，僅瞬時表達。目前已有含有ndrg2S的重組病毒構建成功。
　　為了深入研究ndrg2基因的功能，明確ndrg2L對膠質瘤細胞的作用及其機制，為探索ndrg2的抗腫瘤機制，同時為進一步探索膠

5、質瘤發(fā)病機制和新的治療策略，本課題組擬建立ndrg2長短兩種亞型的重組腺病毒，并利用其感染人腦膠質瘤細胞系后進行細胞生物學檢測，今后進一步對該基因進行深入研究。
　　首先，采用腺病毒表達系統(tǒng)Vira Power TM Adenoviral Expression System構建腺病毒載體。首先將ndrg2兩種亞型（長短2種亞型分別命名為ndrg2L，ndrg2S）利用酶切、連接、轉化、擴增后提取質粒等方法克隆入入門載體pENTR2

6、B以獲得入門克隆pENTR2B-ndrg2L，pENTR2B-ndrg2S，雙酶切及PCR鑒定正確后，用重組酶LR Clonase TM II Enzyme Mix進行入門克隆與表達載體pAd-CMV/V5-DEST間的重組反應以獲得表達克隆pAd-CMV/V5-DEST-ndrg2L和pAd-CMV/V5-DEST-ndrg2S的質粒。表達克隆經(jīng)PCR鑒定后用限制性內切酶PacI線性化后轉染HEK293A包裝細胞得到重組腺病毒（分別命

7、名為Ad-ndrg2L和Ad-ndrg2S），經(jīng)過反復的感染擴增后，用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量法（Tissue culture infective dose 50，TCID50）檢測病毒滴度，用Western Blot檢測重組病毒載體是否能正確表達ndrg2蛋白。結果成功構建了ndrg2基因長短2種亞型的重組腺病毒載體，并包裝擴增病毒，可為腫瘤基因治療的研究提供依據(jù)。
　　為了探知ndrg2新的變異型(ndrg2L)是否具有抗腫瘤作用

8、，如有作用，ndrg2基因長短兩種亞型抗腫瘤作用又有無差異？本實驗還采用了流式細胞術，MTT法，平板克隆形成實驗的方法對用ndrg2基因長短兩種亞型腺病毒感染后的膠質瘤細胞進行了檢測?？梢钥吹剑豪昧魇郊毎麅x檢測細胞周期，感染ndrg2兩亞型腺病毒的膠質瘤細胞處于G1期的細胞數(shù)，多于感染EGFP病毒和未感染病毒的膠質瘤細胞G1期細胞數(shù)。MTT實驗的結果表明：感染ndrg2兩亞型腺病毒的膠質瘤細胞，與感染EGFP病毒和未感染病毒的膠質瘤細