華支睪吸蟲(chóng)CsSCCRO基因的發(fā)現(xiàn)及其功能初步研究.pdf

1、華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)長(zhǎng)期寄生于肝膽管部位所引起的疾病稱(chēng)華支睪吸蟲(chóng)病，又稱(chēng)肝吸蟲(chóng)病，是一種食源性的人獸共患寄生蟲(chóng)病。 華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)輕度感染不會(huì)產(chǎn)生明顯臨床癥狀，易被忽視，患者長(zhǎng)期帶蟲(chóng)，蟲(chóng)體的分泌/代謝產(chǎn)物及蟲(chóng)體本身的機(jī)械刺激，對(duì)肝膽系統(tǒng)造成慢性損害，可引起膽管局限性擴(kuò)張、膽管上皮增生、管壁增厚、管腔狹窄、膽管炎、膽管肝炎和肝硬化甚至誘發(fā)肝膽管腫瘤。 流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示：華支睪吸蟲(chóng)病并發(fā)膽管癌的發(fā)生率高達(dá)14％-47.6％，并

2、且流行區(qū)膽管癌較肝細(xì)胞癌更多見(jiàn)；病理學(xué)資料表明：華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)可引起膽管上皮脫落，膽管腺瘤樣增生和炎癥反應(yīng)，晚期在腺瘤樣增生邊緣出現(xiàn)鱗狀化生，膽管的腺瘤樣增生組織產(chǎn)生退化及纖維化和惡性變；我國(guó)珠江三角洲地區(qū)的膽管癌患者很多都合并華支睪吸蟲(chóng)感染，有的甚至在癌組織切片中找到華支睪吸蟲(chóng)卵碎片，此種癌多數(shù)為低分化癌。 人鱗狀上皮癌腫瘤相關(guān)基因(squamouscellcarcinoma-relatedoncogene，SCCRO)研究發(fā)

3、現(xiàn)，該基因定位于人類(lèi)染色體3q26.3上，氨基酸序列含有螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)與核轉(zhuǎn)錄因子類(lèi)癌基因相類(lèi)似，具有潛在轉(zhuǎn)錄因子作用。SCCRO轉(zhuǎn)染的裸鼠具有形成未分化侵襲瘤的作用，并且與局部的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。SCCRO的大量表達(dá)與人類(lèi)多種鱗狀上皮癌的侵襲，轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 盡管有充分的證據(jù)表明，華支睪吸蟲(chóng)的感染是引發(fā)肝膽管癌的一個(gè)重要因素，但是至今仍缺乏明確的分子水平的實(shí)驗(yàn)證據(jù)；另一方面，華支睪吸蟲(chóng)是否存在與人鱗狀上皮

4、癌腫瘤相關(guān)基因相類(lèi)似的基因，是否也具有與其相類(lèi)似的作用?都值得進(jìn)一步探討。 研究目的從華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)中篩選出與人鱗狀上皮癌腫瘤相關(guān)基因相類(lèi)似的基因，探討其與肝膽管癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，為華支睪吸蟲(chóng)感染引起肝膽管腫瘤提供分子生物學(xué)依據(jù)，同時(shí)豐富華支睪吸蟲(chóng)基因組學(xué)和功能基因組學(xué)研究。 研究方法1華支睪吸蟲(chóng)CsSCCRO基因的發(fā)現(xiàn)和生物信息學(xué)分析從華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)測(cè)序后unigene歸并、拼接，獲得與人鱗狀

5、上皮癌相關(guān)腫瘤基因相類(lèi)似的基因，暫命名為CsSCCRO。測(cè)序、分析是否為全長(zhǎng)基因，然后利用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)此基因的cDNA序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能分析，包括核酸水平和氨基酸水平的同源性分析、以及推導(dǎo)的CsSCCRO蛋白的理化性質(zhì)及空間結(jié)構(gòu)分析。 2華支睪吸蟲(chóng)CsSCCRO基因克隆、表達(dá)和Western-blotting鑒定 2.1華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)CsSCCRO基因的擴(kuò)增、克隆 根據(jù)目的基因的ORF和原核表達(dá)質(zhì)粒

6、pET-30a(+)設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增CsSCCRO基因的cDNA全長(zhǎng)編碼區(qū)。限制性?xún)?nèi)切酶XhoⅠ、EcoRⅤ雙酶切空質(zhì)粒pET-30a(+)和PCR產(chǎn)物，T4連接酶連接。用PCR、酶切及測(cè)序鑒定。 2.2華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)CsSCCRO基因的表達(dá)和純化 將pET-30a(+)-CsSCCRO重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL-21中表達(dá)，IPTG誘導(dǎo)后超聲裂解破碎，最后用Ni-NTAAgarose蛋白純化柱純化目的蛋白，核酸蛋白

7、定量分析儀DU530(Beckman)測(cè)濃度。 2.3華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)CsSCCRO蛋白的Western-blotting鑒定采用SDS-PAGE電泳和Westernblotting方法，一抗分別用長(zhǎng)期感染華支睪吸蟲(chóng)的貓血清和輕度感染的大鼠血清(均為1：100稀釋)，以GST1為陽(yáng)性對(duì)照，來(lái)檢測(cè)CsSCCRO蛋白的免疫原性。 3華支睪吸蟲(chóng)CsSCCRO的細(xì)胞生物學(xué)功能初步研究 3.1CsSCCRO蛋白刺激大鼠卵圓細(xì)

8、胞的作用探討 將卵圓細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后按一定濃度加入目的蛋白刺激，以PBS為陰性對(duì)照進(jìn)行MTT試驗(yàn)。在細(xì)胞生長(zhǎng)的12h、24h、36h、48h、60h等五個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞492nm的吸光度，來(lái)反映細(xì)胞的生長(zhǎng)變化；提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞的總mRNA，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因c-myc和CD44表達(dá)量的變化。 3.2將CsSCCRO基因轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞和大鼠肝卵圓細(xì)胞作用探討構(gòu)建pEGFP-N

9、1-CsSCCRO真核重組質(zhì)粒，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-CsSCCRO入Hela細(xì)胞和大鼠肝卵圓細(xì)胞，熒光倒置顯微鏡觀察CsSCCRO的表達(dá)，為進(jìn)一步的功能研究打下基礎(chǔ)。 研究結(jié)果1華支睪吸蟲(chóng)CsSCCRO基因的編碼序列結(jié)構(gòu)分析從華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)與人鱗狀上皮癌腫瘤相關(guān)基因相類(lèi)似的基因，暫命名為CsSCCRO；CsSCCRO是完整的全長(zhǎng)基因，該基因全長(zhǎng)1218bp。其ORF含堿基780bp，起始密碼子為ATG

10、，終止密碼子為T(mén)GA，編碼259個(gè)氨基酸。其推導(dǎo)氨基酸序列與人鱗狀上皮癌基因編碼蛋白一致性達(dá)到50％，保守功能域分析發(fā)現(xiàn)該序列含有螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，與核轉(zhuǎn)錄因子類(lèi)癌基因相似；其編碼氨基酸理論分子量為30500，理論P(yáng)I值5.46。 2華支睪吸蟲(chóng)CsSCCRO基因克隆、表達(dá)和Western-blotting鑒定用設(shè)計(jì)的引物PCR從cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增CsSCCRO編碼區(qū)cDNA序列，用瓊脂糖電泳鑒定在略大于750bp處

11、，測(cè)序確定為780bp。定向克隆獲得的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)-CsSCCRO經(jīng)PCR、雙酶切和/或測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒在IPTG終濃度1mmol/L，28℃下誘導(dǎo)表達(dá)可溶性重組融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE顯示與目的蛋白分子量相符，重組蛋白經(jīng)親和層析純化后得到純化后的目的蛋白。 Westernblotting證實(shí)長(zhǎng)期自然感染華支睪吸蟲(chóng)的貓血清能與原核表達(dá)的CsSCCRO蛋白相結(jié)合，說(shuō)明在華支睪吸蟲(chóng)長(zhǎng)期感染過(guò)程中

12、目的蛋白可以刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，具有一定的免疫原性。對(duì)于輕度感染華支睪吸蟲(chóng)的大鼠血清則不能與目的蛋白相結(jié)合，提示目的蛋白不宜作為感染早期診斷分子。 3華支睪吸蟲(chóng)CsSCCRO的細(xì)胞生物學(xué)功能初步研究 CsSCCRO蛋白刺激大鼠卵圓細(xì)胞的MTT結(jié)果顯示：目的蛋白在適當(dāng)?shù)臐舛认吕诩?xì)胞大鼠肝卵圓細(xì)胞的生長(zhǎng)，。半定量PCR結(jié)果表明：目的蛋白刺激后c-myc的表達(dá)量輕度升高，而CD44表達(dá)量則無(wú)明顯變化。 CsSCCRO能

13、夠在Hela細(xì)胞中高效表達(dá)，而在大鼠肝卵圓細(xì)胞中則很難見(jiàn)到綠色熒光蛋白的表達(dá)。這一方面可能與CsSCCRO蛋白對(duì)大鼠肝卵圓細(xì)胞有一定的毒性有關(guān)，另一方面，也可能與大鼠肝卵圓細(xì)胞自身特性不適于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染有關(guān)。 研究結(jié)論1.首次在華支睪吸蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)了與人鱗狀上皮癌相關(guān)腫瘤基因同源性較高的基因，暫命名為CsSCCRO。 2.CsSCCRO蛋白能夠促進(jìn)大鼠肝卵圓細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且使腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因c-myc的表達(dá)量增加。這提示CsS