17368.褶紋冠蚌cdna文庫構建與timp基因的表達

1、學位論文獨創(chuàng)性聲明學位論文獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。據我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得直昌太堂或其他教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學位論文作者簽名(手寫)：相參靶簽字日期：。阻年6月，之日學位論文版權使用授權書本學位論文作者完

2、全了解南昌大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權南昌大學可以將學位論文的全部或部分內容編入有關數據庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編本學位論文。同時授權中國科學技術信息研究所和中國學術期刊(光盤版)電子雜志社將本學位論文收錄到《中國學位論文全文數據庫》和《中國優(yōu)秀博碩士學位論文全文數據庫》中全文發(fā)表，并通過網絡向社會公眾提供信息服務。(

3、保密的學位論文在解密后適用本授權書)學位論文作者簽名(手寫)：陽壺靶簽字日期：≯口，z年占月肛日簽字日)：月／多日摘要lIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIY2141411摘要褶紋冠蚌(CristariaPlicata)是中國“淡水育珠蚌”之一，由于其易受病原體侵染而經常發(fā)病，給其育珠能力產生了較大的影響。因此對其進行分子免疫方面的研究是有必要和實際意義的。本文用Trizol法提取總RNA，依據SMART試劑盒說明方法合成cDNA，

4、用sfiI酶切，將處理過的PCR產物和pBluescriptIISK載體相連接，構建褶紋冠蚌血細胞全長cDNA文庫。經檢測，其滴度為107x106cfu／mL，重組率為96％，平均插入片段為732bp。說明所構建的褶紋冠蚌血細胞文庫屬質量高的全長cDNA，挑500個克隆進行測序，獲得297條EST，經分析，己知功能的ESTs為123個，按生物學功能把它們可以分成了七類。對堿基為821bp的EST片段，進行比對分析后，認為它是褶紋冠蚌TI

5、MP基因，經測定發(fā)現它在閉殼肌中表達最大，而在血細胞、外套膜、肝胰腺和性腺中表達量則低得多。注射嗜水氣單胞菌6，12，24，48h后，經熒光定量分析測定，其在血細胞，肝胰腺，鰓表達水平均有一定量的升高。設計含酶切位點的表達引物，從褶紋冠蚌的血液中提取總RNA，利用RT—PCR法擴增出TIMP基因，經基因序列分析后構建表達載體PET一30a()一TIMP，轉化大腸桿菌BL21，再經過IPTG誘導TIMP表達，利用SDS—PAGE分析表達產

6、物。最后利用N2_NTA將其融合蛋白純化出來。結果表明重組的TIMP在大腸桿菌(Escherichiacoli)37。C下誘導均以包涵體形式存在，大小為32KDa左右；其N端表達產物為20KDa左右。優(yōu)化表達條件后，加lmMIPTG，15。C下誘導34h，其N端表達產物有可溶性蛋白存在，并可以純化出來。即可通過基因克隆和原核表達的方式可以獲得具有生物活性的T／MP融合蛋白。關鍵詞：褶紋冠蚌，cDNA文庫，EST(表達序列標簽)，TIMP