28598.atg5小鼠胚胎成纖維細(xì)胞耐受活性氧誘導(dǎo)的非自噬依賴的細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究

1、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文Atg5小鼠胚胎成纖維細(xì)胞耐受活性氧誘導(dǎo)的非自噬依賴的細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究姓名：孫向玨申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：衛(wèi)生毒理學(xué)指導(dǎo)教師：朱心強(qiáng)沈漢明20100201浙江人學(xué)碩I：學(xué)位論文中文摘要活性氧族(reactiveoxygenspecies，ROS)是一組高反應(yīng)活性的分子，包括單態(tài)氧、氫氧自由基、超氧陰離子、一氧化氮和過(guò)氧化氫。研究表明，ROS在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。由細(xì)胞內(nèi)線粒體或其他途徑產(chǎn)生的

2、ROS，可以氧化一系列細(xì)胞內(nèi)成分，包括脂類、蛋白質(zhì)和DNA，進(jìn)而損傷細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。對(duì)于細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡兩種重要的生命活動(dòng)間相互作用的機(jī)制不明，是目前自噬研究的一個(gè)瓶頸；而Atg基因在這其中發(fā)揮了何種作用，也是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題，只有進(jìn)一步明確各關(guān)鍵Atg基因在其他生命活動(dòng)過(guò)程中所扮演的角色，才有可能更好的分析自噬與其他生命活動(dòng)的聯(lián)系，更好地把握自噬，利用自噬。鑒于自噬和細(xì)胞凋亡在生命過(guò)程中的重要作用，而對(duì)于兩者之間相互作用的研究不

3、甚明確，為了探索自噬和細(xì)胞凋亡之間的相互調(diào)節(jié)，本實(shí)驗(yàn)擬選用At954小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(At95／MEFs細(xì)胞)作為特異性自噬缺失細(xì)胞，和野生型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(WTMEFs細(xì)胞)一起作為研究對(duì)象，觀察兩種MEFs細(xì)胞對(duì)由硝普鈉(sodiumnitroprusside，SNP)和過(guò)氧化氫(hydrogendioxide，H202)兩種ROS引起的細(xì)胞凋亡的反應(yīng)情況，并通過(guò)雷帕霉素(rapamycin，Rapa)或氯喹(chloroqu

4、ine，CDP)的預(yù)處理和抑制相關(guān)自噬基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)wTMEFs的自噬水平，探究自噬和細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系及其潛在機(jī)制。【方法】1、細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理：wT和At95／MEFs細(xì)胞培養(yǎng)在含10％小牛血清和1％青霉素一鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于含5％C02，37(2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。藥物處理時(shí)，分別給予SNP(10mM)和H202(025mM)，各作用3，6，9，12h。2、細(xì)胞死亡／凋亡的測(cè)定1)流式細(xì)胞術(shù)PI活細(xì)胞染色：藥物處理后