PRRSV GP5蛋白基因疫苗的構建及鑒定和三種分子佐劑的制備.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是能夠引起妊娠母豬繁殖障礙和嚴重呼吸系統(tǒng)癥狀的一種傳染性疾病，本病的病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV），主要靶細胞是豬肺泡巨噬細胞。主要傳播途徑是空氣傳播、接觸感染和精液傳播，該病毒具有極強的傳染性，常常給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。糖基化囊膜蛋白（GP5）含有2-4個糖基化位點，是病毒的主要保護性中和抗原，其

2、誘導產生中和抗體，能夠中和病毒，使病毒失去感染性，是新型基因疫苗設計的主要靶蛋白。
　　基因疫苗又稱為DNA疫苗，即將外源性抗原基因連接到真核表達載體上，構建重組質粒，然后將質粒導入宿主體內，并在宿主細胞內表達抗原蛋白，刺激機體免疫系統(tǒng)，產生免疫應答反應。一定時限內，抗原基因在宿主細胞內持續(xù)表達，激活機體免疫應答，達到預防疾病的目的。與滅活疫苗、弱毒疫苗等相比基因疫苗具有生產成本低、便于儲存和運輸、持續(xù)性強、使用安全等優(yōu)點，對于疾

3、病作用顯著，能夠誘導產生更有效的免疫應答反應，但是核酸疫苗也有抗體產生慢、水平低等問題，配以有效佐劑是克服這些問題的有效途徑之一。
　　第二信使c-di-GMP、c-di-AMP、2’-3’cGAMP作為在細菌中發(fā)現(xiàn)的信號分子，在細菌的致病力、細胞壁的代謝平衡、細菌的生長以及生物膜形成等方面起到至關重要的作用，在真核生物體內，能夠作為信號分子被宿主識別，激活先天免疫應答。第二信使作為一種免疫調節(jié)劑，能夠很好的調節(jié)機體的免疫功能，因

4、此，可成為具有潛力的免疫佐劑。
　　本實驗構建了PRRSV GP5基因調控型真核表達質粒，并對其在真核細胞中的表達做了研究，摸索了c-di-GMP、c-di-AMP、2’-3’ cGAMP的制備及純化方法，具體研究內容如下：
　　1. PRRSV GP5基因調控型真核表達質粒的構建及驗證
　　提取實驗室保存的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的總RNA，RT-PCR擴增的到GP5基因cDNA，克隆到基因調控型表達載體pXJ41上，

5、轉化大腸桿菌TransT1感受態(tài)，經(jīng)過酶切鑒定后測序，沒有堿基突變，得到pXJ41-GP5重組質粒，轉染到Hela細胞當中，經(jīng)間接免疫熒光和Western Blot實驗證明，pXJ41-GP5重組質粒，能夠在真核細胞內表達。
　　2. c-di-GMP、c-di-AMP、2’-3’ cGAMP的制備及檢測方法
　　分別挑取含有霍亂弧菌VCA0956（合成c-di-GMP所必需的酶蛋白），VC0179（合成c-di-AMP所必

6、需的酶蛋白）基因，以及含有mcGAS（合成2’-3’cGAMP所必需的酶蛋白）基因表達序列的大腸桿菌菌株，16℃低溫誘導表達，利用Ni-NTA親和層析制備VCA0956、VC0179、mcGAS三種酶蛋白，經(jīng)過SDS-PAGE驗證確定得到的蛋白即為目的蛋白，然后經(jīng)分子篩層析純化三種酶蛋白。在酶和底物存在的情況下，根據(jù)c-di-GMP、c-di-AMP、2’-3’cGAMP的反應式，建立酶促反應體系，制備三種分子佐劑，經(jīng)過摸索反相高效液相