PRRSV GP5蛋白單克隆抗體的制備、診斷方法的建立及核酸疫苗研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征最早流行于美國，現(xiàn)在遍布全球，給全球的養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失，對該病的診斷與預防顯得尤為重要。該病的診斷方法很多，主要分為抗原檢測:PCR、實時熒光定量PCR;抗體檢測:IFA、IPMA、SVN、EILSA。與其他方法做比較，ELISA方法更容易操作，用時短，敏感，適合用于進行流行病學調查和疫苗免疫效果的評價。接種疫苗是預防與控制該病的主要手段，目前用于預防PRRS的常用疫苗是弱毒苗和滅活苗。弱毒疫苗雖然能提供較好的免疫保

2、護，但存在毒力返強的危險。滅活疫苗不僅需多次重復接種，而且效果不穩(wěn)定，還經常導致免疫失敗。目前迫切需要更加安全、有效的疫苗來預防和控制該病的發(fā)生與流行。PRRSV ORF5基因翻譯產生的GP5蛋白能誘導中和抗體的產生，在豬感染PRRSV后康復豬血清中的中和抗體主要作用GP5蛋白，因此GP5蛋白成為了PRRS新型疫苗和診斷試劑的較好靶蛋白。鑒于此，本課題研究了GP5蛋白的表達，針對GP5蛋白的單克隆抗體的制備，PRRSV GP5-ELIS

3、A診斷方法的建立，以及PRRSV核酸疫苗的研究。
　　 1.GP5蛋白在大腸桿菌中的高效表達
　　 由于全長ORF5基因在大腸桿菌中表達量低或不表達，根據ORF5的結構特點，設計一對引物擴增截取信號肽后的ORF5序列，并將其克隆到載體pGEX-KG中，構建與GST融合表達的原核表達質粒pGEX-KG-ORF5，在IPTG誘導下獲得高效表達。表達的融合蛋白GST-GP5分子量為38kDa，主要以包涵體形式存在。
　　

4、 2.PRRSV WUH3株GP5蛋白單克隆抗體的制各
　　 將原核表達的PRRSV GP5蛋白純化后作為免疫原，免疫4周齡BALB/C雌性小鼠，經細胞融合，間接ELISA方法篩選，共獲得4株抗GP5蛋白的單克隆抗體(4A11、3D10、1E9、1H11)。將4株雜交瘤細胞分別注射小鼠后，大量制備腹水。將構建的真核表達質粒PCAGGS-HA-SynORF5轉染Hela細胞后，收集樣品。經Western blotting和IFA

5、驗證表明只有4A11、1H11能與真核表達的GP5蛋白發(fā)生特異性反應。
　　 3.PRRSV GP5-ELISA診斷方法的建立
　　 用構建的原核表達質粒pGEX-KG-ORF5表達的融合蛋白GST-GP5作為檢測PRRSV抗體的抗原。先包被GST單抗在加GST-GP5蛋白，以此來建立檢測PRRSV抗體的方法。經過方陣滴定確定GST最佳稀釋度為1∶10000，GST-GP5蛋白的濃度為2μg/mL。本研究建立的PRRSV

6、抗體的診斷方法具有良好的特異性和重復性，檢測208份臨床血清與PRRSV進口試劑盒IDEXX的總符合率為86.1％。
　　 4.PRRSV核酸疫苗的構建、免疫小鼠后的體液免疫和細胞免疫
　　 利用PCR和酶切的方法將SynORF5、APCH1插入真核表達質粒PCAGGS-HA中，構建了共表達GP5和APCH1蛋白的真核表達質粒PCAGGS-HA-APCH1-Syn-ORF5、只表達GP5蛋白的真核表達質粒PCAGGS-H

7、A-SynORF5以及只表達APCH1蛋白的真核表達質粒PCAGGS-HA-APCH1。通過Western blot證實各真核表達質粒在Hela細胞中均能正確表達目的蛋白。為了研究APCH1蛋白能否使GP5蛋白的免疫原性增強，將真核表達質粒PCAGGS-HA-APCH1-SynORF5、PCAGGS-HA-Syn-ORF5和PCAGGS-HA-APCH1以及空白載體PCAGGS-HA分別免疫BALB/c小鼠，進行免疫反應效果的評價，結果

8、APCH1和GP5蛋白共表達的質粒PCAGGS-HA-APCH1-SynORF5所誘導的針對GP5蛋白的ELISA抗體顯著高于單獨表達GP5蛋白的PCAGGS-HA-SynORF5免疫組(P＜0.05)，但是所誘導中和抗體不顯著高于單獨表達GP5蛋白的PCAGGS-HA-SynORF5免疫組(P＞0.05)。在第一次免疫后第6周，分離小鼠脾淋巴細胞，用滅活的PRRSV刺激后，用檢測IFN-γ水平的 ELISA試劑盒檢測 IFN-γ的表達