禽呼腸孤病毒感染對體外細胞和SPF雞細胞因子mRNA轉錄影響的初步研究.pdf

1、禽呼腸孤病毒(Avian reovirus,ARV)是重要的家禽病原體之一,主要感染雞和火雞,引起雞病毒性關節(jié)炎、矮小綜合征、呼吸障礙綜合征、免疫抑制等,給全球養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經濟損失。但目前關于ARV主要的研究方向是病原分離鑒定、基因組測序、檢測方法建立等,而對其分子致病機制的研究報道并不多。為了從根本上有效防控ARV感染,促進全球養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展,開展禽呼腸孤病毒致病機制的研究刻不容緩。細胞因子因具有廣泛的生物學活性,是機體免疫應答

2、和炎癥反應的重要介質。目前已證明細胞因子在結核病、AIV感染、雞傳染性法氏囊病毒感染、球蟲感染等疾病的致病過程中占有重要作用,但細胞因子在ARV感染導致機體廣泛炎癥和免疫抑制中的致病機制尚不清楚。
　　為探討ARV感染對細胞因子IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ和TNF-α的mRNA轉錄時相的影響,本研究首先建立了雞IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ、TNF-α和GAPDH基因的SYBR

3、 GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法,然后用禽呼腸孤病毒標準強毒株 S1133分別感染雞胚成纖維細胞(CEF)和7日齡SPF雛雞,利用已建立的方法檢測分析IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ、TNF-α在體外細胞和SPF雞不同組織器官(關節(jié)、心臟、脾臟、胸腺、法氏囊和外周血白細胞)中不同時間的mRNA表達水平。并利用流式細胞術檢測ARV感染SPF雞外周血淋巴細胞CD4+和CD8+T細胞量的變化。
　　根據(jù)Gen

4、Bank上公布的雞IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ和TNF-α和GAPDH基因序列,設計合成特異性引物,再以雞胚成纖維細胞cDNA為模版構建的重組質粒作為標準品,然后構建SYBR GreenⅠ熒光定量PCR標準曲線,并進行熔解曲線分析。結果顯示各基因的溶解曲線均呈單一溶解峰,擴增效率在95.6％-102.0%之間,線性相關性R2均>0.99,且各基因檢測下限均為102拷貝數(shù),組內變異系數(shù)均小于2.0%。說明本研究

5、建立的檢測方法特異性好,敏感性佳,重復性好。
　　運用已建立的熒光定量 PCR技術,檢測分析 ARV標準強毒株 S1133感染雞胚成纖維細胞后,ARV結構蛋白σC和IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ和TNF-α的mRNA動態(tài)轉錄水平。結果表明,ARV-S1133感染CEF10h后病毒結構蛋白σC mRNA的相對表達量開始迅速上升,在48h達到最高峰(13162.73倍,P<0.01);ARV-S1133感染后

6、引起CEF中的IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ和TNF-αmRNA表達量發(fā)生變化。IL-1β、IL-6、IL-17、IFN-γ和TNF-α基因的mRNA相對表達量在感染36h、48h、60h顯著上調(P<0.05),且在48h達到峰值,表達量分別是88.78、40.43、97.19、111.58和4.4倍;IL-18 mRNA轉錄水平在整個感染過程中表達量較低,在感染中后期,其表達量呈下調趨勢;用ARV病毒5個不

7、同接種劑量(105、104、103、102、101個TCID50)的感染CEF24h后,6個細胞因子的表達量與病毒的接種劑量線性相關,其中IL-1β、IL-6、IL-17和IFN-γ表達水平與病毒接種劑量正相關,IL-18和TNF-αmRNA表達水平與病毒接種劑量負相關。結果表明L-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ和TNF-α與ARV的病毒復制和致病過程相關。
　　運用已建立的熒光定量PCR技術,檢測分析ARV

8、S1133株經足墊注射感染7日齡SPF雞后,不同組織器官(關節(jié)、心臟、脾臟、胸腺、法氏囊和外周血)中IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ、TNF-α的相對表達動態(tài)。結果表明 ARV感染可引起上述細胞因子mRNA轉錄水平發(fā)生變化,但各細胞因子在不同組織中變化情況不盡相同,提示上述細胞因子可能參與了ARV感染后不同組織器官的損傷過程。其中IL-1β、IL-6、IL-17、IFN-γ、TNF-α在關節(jié)中表達量呈上調趨勢,說

9、明它們與ARV感染的關節(jié)病變相關。心臟中IL-18在感染14d和28d分別顯著上調16.29倍和26.15倍(P<0.01),提示IL-18可能與ARV感染所致的心臟損傷相關。IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ、TNF-α在不同免疫器官中均有不同程度的上調,表明它們可能與ARV引起的免疫抑制有關。
　　本研究利用流式細胞術測定SPF雞在ARV感染過程中,雞外周血淋巴細胞 CD4+和CD8+T細胞含量的變化。結

10、果表明,SPF雞感染 ARV后7d和14d CD4+、CD8+T細胞量高于對照組,其中CD8+T細胞量與對照組相比差異顯著(P<0.05),提示CD4+和CD8+T細胞可能參與機體抵抗ARV的感染過程;感染后1d感染組CD4+、CD8+T細胞量顯著低于對照組(P<0.05);感染21d后,CD4+和CD8+T細胞量下降,提示ARV感染可能抑制了T細胞功能。
　　本研究獲得了禽呼腸孤病毒感染的體外細胞和SPF雞組織器官中細胞因子IL