不同啟動子和插入位點表達AIV-H9 HA抗原的重組馬立克氏病病毒的構建和比較研究.pdf

1、馬立克氏病病毒(Marek's Disease Virus，MDV) GX0101株是我們實驗室在2001年從廣西某雞場中分離到一株帶有禽網狀內皮組織增生癥病毒(REV)長末端重復序列(LTR)的1型MDV GX0101，其致病型為超強毒。將該毒株構建成細菌人工染色體(BAC)克隆，并在此傳染性克隆的基礎上進行了一系列的研究。其中敲除了GX0101兩個致腫瘤基因Meq，構建了Meq缺失株GX0101△Meq，通過動物實驗證明該突變株不僅

2、失去了雞群的致病性和免疫抑制，而且還可以對雞群起到很好的保護性免疫作用，其保護效果要超過CVI988疫苗。本研究在GX0101△Meq的基礎上，將該突變株作為載體表達H9N2禽流感病毒的HA基因，構建了不同的重組病毒并對這些重組病毒進行了體外和體內的研究。
　　1抗H9N2-HA鼠多克隆抗體的制備及H9N2-HA真核表達載體的構建
　　本研究中構建了9株以GX0101△Meq為載體表達H9N2-HA的重組病毒。為了驗證重組病

3、毒中HA基因在體外的表達，首先制備了H9N2禽流感HA的鼠多克隆抗體，用于后續(xù)研究中HA基因在重組MDV表達的檢測。然后又構建表達H9N2-HA的重組病毒，首先我們需要構建能夠在真核系統(tǒng)中表達HA基因的真核表達質粒。將整段HA基因的ORF克隆到以CMV為啟動子的真核表達載體pcDNA3.1（-）中，并將該真核表達質粒轉染CEF細胞，以上述制備的HA抗體作為一抗用IFA驗證真核表達質粒中HA在CEF中的表達。結果顯示，IFA可以檢測到CE

4、F細胞中HA蛋白的存在，證明本研究中構建的HA真核表達質粒能夠成功表達HA基因，可以用于后續(xù)研究。
　　2應用RedE/T重組系統(tǒng)和Flp/FRT重組系統(tǒng)以兩步重組法構建一株以GX0101△Meq為載體表達H9N2-HA基因的重組病毒rGX-CMV-HA
　　本部分研究主要解決構建重組MDV的方法學問題。我們的研究先后嘗試了不同方法用于構建重組MDV，這些方法包括真核細胞上的同源重組、在BAC系統(tǒng)中的RedE/T重組（應用C

5、ounter-Selection BAC Modification Kit試劑盒）、在BAC中利用RedE/T重組系統(tǒng)和Flp/FRT重組系統(tǒng)，經過近1年半的時間對構建重組MDV的方法學的探索，我們建立一種非常方便的構建重組MDV的方法。
　　首先在HA基因表達盒前引入Kanr抗性篩選基因，然后利用RedE/T重組系統(tǒng)在大腸桿菌EL250中將這段帶有抗性篩選基因的HA表達盒作為外源插入片段整合到GX0101△Meq載體質粒上，再利

6、用Flp/FRT重組系統(tǒng)在L-阿拉伯糖的誘導下將Kanr抗性篩選基因從重組子中敲除掉。將通過驗證完全敲除了Kanr抗性篩選基因的重組質粒prGX-CMV-HA從EL250大腸桿菌中提取出來，轉染CEF細胞拯救病毒，并通過IFA驗證重組病毒中HA基因的表達。結果表明，通過這種兩步重組法，我們成功獲得了重組病毒rGX-CMV-HA，并且IFA驗證HA基因在重組病毒感染的CEF中成功表達。
　　3以GX0101△Meq為載體的重組MDV

7、中不同啟動子轉錄H9N2-HA基因的活性比較
　　為了研究不同的啟動子在重組MDV中轉錄HA基因的活性，本研究中以GX0101△Meq為載體，利用前期探索的兩步重組法，在已經構建好的重組病毒rGX-CMV-HA的基礎上又構建了4株不同的重組病毒。這些重組病毒分別用了5個不同的啟動子轉錄HA基因，這5個啟動子包含3個內源啟動子和2個外源啟動子，內源啟動子是來自GX0101△Meq載體自身的gB基因啟動子(gB)和另一個來自GX010

8、1△Meq載體自身的位于PP38和1.8kb RNA轉錄子之間的雙向啟動子的兩個方向，即PP38方向(pPP38)和1.8kb RNA轉錄子方向(p1.8kb)。外源啟動子分別為CMV啟動子和SV40啟動子。我們對這5個不同的重組病毒進行了體外和體內的比較研究，結果顯示，在細胞培養(yǎng)中，重組病毒rGX-CMV-HA中HA基因轉錄水平最高， rGX-SV40-HA和rGX-p1.8kb-HA兩者轉錄外源基因的能力幾乎在同一水平，其他兩個內源

9、啟動子pPP38和gB在重組病毒中轉錄HA基因的水平較低，其中rGX-pPP38-HA處在最低的水平。雙向啟動子的兩個方向pPP38和p1.8kb的轉錄水平差異較大，rGX-p1.8kb-HA的轉錄水平要明顯超過rGX-pPP38-HA轉錄HA的水平。動物實驗證明，5個重組病毒均可以在體內復制，但均不能誘發(fā)機體產生抗體，rGX-CMV-HA，rGX-SV40-HA，rGX-p1.8kb-HA均不能對雞群起到保護效果。而重組病毒rGX-g

10、B-HA的有25％的雞得到保護，重組病毒rGX-pPP38-HA可以給感染雞提供50％的保護。
　　4重組病毒中GX0101△Meq載體上的不同插入位點對表達HA外源基因的影響
　　為了研究GX0101△Meq載體上的不同插入位點對表達HA外源基因的影響，我們根據不同啟動子在重組GX0101△Meq中轉錄HA基因活性大小的研究結果，選擇處于中等轉錄活性強度的雙向啟動子的1.8kb轉錄子方向(p1.8kb)作為啟動子轉錄HA基

11、因，同時選擇了GX0101△Meq載體上病毒復制非必須區(qū)US2、US10、Meq以及BAC骨架上的gpt基因位點作為靶位點，分別將HA表達盒整合到這些區(qū)域，將這些構建的重組病毒rGX-US2-HA，rGX-US10-HA，rGX-Meq-HA和rGX-gpt-HA感染CEF細胞，利用ELISA和熒光定量RT-PCT分別研究這些病毒在細胞培養(yǎng)上表達HA蛋白水平和轉錄mRNA水平的差異。通過接種雞的實驗研究這些不同重組病毒對雞群的保護效果。

12、結果顯示，在細胞培養(yǎng)上，在GX0101△Meq載體上的不同位點表達外源HA基因無論是在蛋白水平還是在mRNA水平上都有差異，在US2區(qū)表達外源基因的活性最強，其次是US10和Meq區(qū)，我們所選擇的外源插入gpt位點表達HA基因的能力最弱。體內試驗結果顯示，4株重組病毒均可以在體內復制，但是都不能誘發(fā)可檢測到的血清中針對H9N2的抗體。重組病毒rGX-US2-HA、rGX-US10-HA和rGX-gpt-HA對SPF雞沒有任何保護效果，但