副豬嗜血桿菌耐藥性調查和耐藥機制研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)是引起豬的多發(fā)性漿膜炎、腦膜炎和關節(jié)炎的一種革蘭氏陰性桿菌。副豬嗜血桿菌病又稱為Gl(a)sser's病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。副豬嗜血桿菌具有15個血清型和不可分型菌株，有很強的宿主特異性，2周齡到4月齡的豬易感，尤其對早期斷奶仔豬造成了嚴重的危害。目前主要通過滅活苗和抗生素來預防和控制副豬嗜血桿菌病，但單價疫苗免疫不能產生交叉保護作用，所以通過抗生素進行預防和

2、治療該病，仍是一種常見的方法。而抗生素的不合理使用導致越來越多的細菌對抗生素產生了耐藥性，嚴重影響了抗生素的殺菌作用。近年來，許多國家都報道了副豬嗜血桿菌存在耐藥現(xiàn)象，因此，有必要對副豬嗜血桿菌進行耐藥性調查和耐藥機制研究。本研究首先對臨床菌株進行了耐藥流行病學調查和內源性質粒的分離鑒定，然后分析青霉素結合蛋白的突變位點與氨芐青霉素耐藥菌株和攜帶內源性質粒菌株之間的關系。同時，通過基因表達譜芯片研究副豬嗜血桿菌SH0165在亞抑制濃度和

3、抑制濃度替米考星作用下的轉錄組學變化，揭示了亞抑制濃度和抑制濃度（0.25μg/mL和8μg/mL）替米考星的作用機制。現(xiàn)將主要研究結果報告如下:
　　 1.副豬嗜血桿菌的耐藥流行病學調查和內源性質粒的分離鑒定
　　 本試驗對2009年分離的92株副豬嗜血桿菌進行了10種常用抗生素的耐藥流行病學調查，其中存在青霉素(21.74％)、氨芐青霉素(23.91％)、林可霉素(23.91％)、阿莫西林(15.22％)等耐藥菌株，

4、對頭孢噻肟和氯霉素敏感的菌株，均為90.22％，而22種耐藥基因檢測存在氨基糖苷類耐藥基因aadB有20株，四環(huán)素類耐藥基因tetB有11株，磺胺類耐藥基因sulⅡ有8株。同時從92株副豬嗜血桿菌中分離出6株菌株攜帶有內源性質粒，并對其中5個內源性質粒進行了測序，質粒FZJ5839是隱性質粒，其余都是耐藥質粒。質粒pHPS1019編碼耐藥基因tetB和復制蛋白rep;質粒FHN1020和質粒FZG1012是來自不同豬場的相同耐藥質粒，編

5、碼了鏈霉素類耐藥基因strA和磺胺類耐藥基因sulⅡ及MOB移動蛋白家族;質粒FJS5863編碼了β-內酰胺類耐藥基因blaRoB-1，氨基糖苷類雙功能修飾酶基因aacA-aphD，MOB移動蛋白家族和復制蛋白rep，其中耐藥基因aacA-aphD首次在副豬嗜血桿菌中報道。隱性質粒FZJ5839是測序中最大的質粒(11，812bp)，編碼了移動蛋白mobA_mobL，重組酶rec，復制蛋白rep和分裂蛋白parA。其中攜帶耐藥質粒的菌株

6、中只有耐藥基因tetB不表現(xiàn)耐藥表型，其余耐藥基因均存在耐藥表型。而對分離的內源性質粒進行耐藥基因檢測，其結果是不僅存在質粒編碼的耐藥基因，也存在耐藥基因blaTEM和dhfr(Ⅴ)等。通過對耐藥質粒進行同源性分析發(fā)現(xiàn)與巴斯德菌屬或嗜血桿菌屬中耐藥質粒進化關系較近。
　　 2.分析副豬嗜血桿菌青霉素結合蛋白的突變位點
　　 根據(jù)HPSSH0165的基因組信息，總結HPS青霉素結合蛋白(Penicillin-binding

7、proteins，PBPs)的類型，主要包括6類PBPs，其中有4個HMMPBPs[2個A類PBPs(mrcA和pbp1B)和2個B類PBPs（ftsⅠ和ftsⅠ-2）]和2個LMMPBPs(dacA和dacB)及1個多功能轉糖酶mtgA和1個PBP3相關的羧基末端蛋白酶prc。通過瓊脂稀釋法對2009年選取的22株和2012年分離的34株HPS進行6種β-內酰胺類抗生素（青霉素，頭孢噻肟，氨芐青霉素，苯唑西林，阿莫西林和克拉維酸）的耐

8、藥檢測，存在氨芐青霉素和苯唑西林抗性的菌株達到95％以上，同時從2012年34株HPS中分離出2個內源性質粒。根據(jù)菌株是否對氨芐青霉素和苯唑西林耐藥，是否攜帶內源性質粒來選取20株HPS進行PBPs的克隆測序（其中2009年和2012年各10株），參考菌株是HPSSH0165和HPS標準5型，測序結果PBPs基因是高度保守的。通過PBPs堿基序列的進化樹關系，預測PBPs存在的突變位點，并在蛋白的三維結構上定位突變位點，分析發(fā)現(xiàn)PBPs

9、肽基轉移酶上的突變位點與β-內酰胺類抗生素耐藥性有關，糖基轉移酶上的突變位點與內源性質粒傳遞有關。在攜帶質粒FJS5863的菌株09FA17中發(fā)現(xiàn)mrcA基因在突變位點638處插入7個氨基酸ATENTTD，導致下游有11個突變位點，并在一定程度上改變了mrcA蛋白的三維結構，推測該突變與菌株攜帶質粒FJS5863編碼的耐藥基因blaROB-1有關。其中有8株菌的dacB基因在氨基酸C-端插入了199個氨基酸，推測與內源性質粒的傳遞有關。

10、有5株菌的dacA基因在358氨基酸處突變?yōu)榻K止密碼子。
　　 3.替米考星誘導副豬嗜血桿菌SH0165的轉錄組學研究
　　 為了揭示替米考星作用于HPSSH0165的分子機制，根據(jù)HPSSH0165的基因組序列，設計了2052個探針合成基因表達譜芯片來研究不同濃度(亞抑制濃度0.25μg/mL和抑制濃度8μg/mL)的替米考星對HPSSH0165的轉錄組學變化，成功篩選到405個差異表達基因(p≤0.05，F(xiàn)c≥1.5

11、)，這些基因涉及到熱休克蛋白、核糖體蛋白、蛋白質的生物合成、細胞壁合成和細胞轉運相關的過程。在0.25μg/mL和8μg/mL兩種濃度組中既存在共同變化的基因也存在其特有的差異表達基因，其中共同上調表達的基因有56個和共同下調表達的基因有39個。在0.25μg/mL濃度組中檢測出302個差異表達基因，在替米考星壓力下正常的生長以調節(jié)ABC轉運體和PTS系統(tǒng)中基因為特點，而在8μg/mL濃度組中檢測出198個差異表達基因，因生長被完全抑制